Regulation der 5-Lipoxygenaseaktivität durch niedermolekulare Verbindungen

Regulation of 5-lipoxygenase activity by low molecular compounds

  • 5-Lipoxygenase (5-LO) katalysiert die ersten beiden Schritte in der Biosynthese der Leukotriene, die an Reaktionen des Immunsystems beteiligt sind. Die 5-LO-Aktivität wird durch verschiedene Faktoren wie Ca2+, Phospholipide und den zellulären Redoxstatus beeinflusst. Die 5-LO besteht aus einer katalytischen und einer N-terminalen, C2-ähnlichen Domäne. Durch Oxidation des Eisens im aktiven Zentrum zur Fe3+-Form wird das Enzym aktiv. Die C2-ähnliche Domäne bindet Ca2+ und PC und ist für die Membranbindung der 5-LO verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit wurde die Aktivierung der 5-LO durch das Diacylglycerid OAG untersucht. Bekannt war die Stimulation der Agonist-induzierten 5-LO-Aktivität in intakten Zellen durch OAG, die nicht auf den bekannten Aktivierungswegen wie Translokation, Phosphorylierung oder Ca2+-Mobilisierung beruht. Hier kann nun die direkte Aktivierung des 5-LO-Enzyms durch OAG in vitro gezeigt werden. Untersucht man den Einfluss von OAG auf die 5-LO-Aktivität in Anwesenheit von 1 mM Ca2+, lässt sich weder an Homogenat, S100 noch am partiell aufgereinigten Enzym aus PMNL ein Effekt beobachten. Entfernt man dagegen Ca2+ aus den Versuchsansätzen, induziert OAG (30 µM) bei Substratkonzentrationen unter 20 µM AA die 5-LO-Aktivität im S100 und am partiell aufgereinigten Enzym. Auch andere Glyceride wie DOG, OG und EAG aktivieren die 5-LO, nicht jedoch SAG. OAG stabilisiert die 5-LO-Aktivität vor der Hemmung durch die Glutathionperoxidase (GPx), dies vermögen ebenfalls andere Glyceride. Damit ähnelt der Einfluss von OAG auf die 5-LO dem bereits bekannten Effekt von Ca2+: es ist in der Lage, vor allem bei niedrigen Substratkonzentrationen die 5-LO-Produktmenge direkt zu erhöhen und kann die 5-LO-Aktivität gegen den inhibitorischen Effekt der Glutathionperoxidase (GPx) stabilisieren. Ähnlich wie Ca2+ scheint OAG die Affinität der 5-LO für das Substrat AA zu erhöhen und das Bedürfnis für aktivierende Hydroperoxide zu erniedrigen. Durch Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit kann eine Beteiligung der Ca2+-Bindungsstelle an der Interaktion zwischen 5-LO und OAG ausgeschlossen werden, da OAG auch an der loop2 mut-5LO die Aktivität zu steigern vermag. Der Anstieg der 5-LO-Produktbildung durch OAG in S100 und am partiell aufgereinigten 5-LO-Enzym lässt sich durch die Zugabe von PC und anderen Phospholipiden unterbinden. Damit erklärt sich gleichzeitig, weshalb OAG am Homogenat aus PMNL keine Effekte zeigt, da hier noch Zellmembran-Bestandteile enthalten sind. Der OAG-Effekt wird wohl über die drei Tryptophan-Reste Trp-13,-75 und -102 der Phospholipid-Bindungsstelle auf der C2-ähnlichen Domäne der 5-LO vermittelt. Dies zeigen auch Untersuchungen an der 3W mut-5LO, bei der die drei Tryptophan-Reste zu Alanin-Resten mutiert sind. Die Aktivität dieser Mutante lässt sich durch OAG unter den bereits beschriebenen Versuchsbedingungen nicht steigern. Ein weiterer Hinweis auf die Phospholipid-Bindungsstelle ist die Interaktion zwischen OAG und dem 5-LO-Inhibitor Hyperforin. Hyperforin selbst hemmt die 5-LO über diese Bindungsstelle, durch OAG wird der IC50-Wert von Hyperforin deutlich erhöht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Lipid Protein Overlay Assay für 5-LO ausgearbeitet, ein direkter Nachweis der Bindung zwischen OAG und 5-LO ist aber bisher nicht gelungen. OAG steigert nicht die Aktivität des 5-LO-Enzyms aus serumfrei kultivierten MM6-Zellen, BL41-E95-A Zellen und transfizierten HeLa-Zellen, auch die Produktmenge der Sojabohnen-LO kann nicht durch OAG beeinflusst werden. Untersucht man die Interaktion von OAG mit aufgereinigter regulatorischer Domäne (MBP-Fusionsprotein, MBP-5LO1-128), so zeigt sich eine weitere Steigerung der durch OAG-induzierten 5-LO-Aktivität, obwohl MBP-5LO1-128 bei höheren Konzentrationen eine Hemmung der 5-LO-Aktivität durch Reduktion der gebildeten 5-HPETE verursacht. Diese Ergebnisse lassen sich damit erklären, dass OAG das Bedürfnis der 5-LO für Hydroperoxide senkt und damit geringere Mengen an 5-HPETE zur Aktivierung der 5-LO ausreichen. Betrachtet man das 5-HETE/5-HPETE-Verhältnis, führt die Zugabe OAG in Abwesenheit von Ca2+ und bei 10 µg MBP-5LO1-128 zu einer geringen Abnahme des 5-HETE-Anteils. Im zweiten Teil der Arbeit wurden neue 5-LO-Inhibitoren identifiziert. Aus der Reihe der Pirinixinsäure-Derivate konnte durch entsprechende Modifikationen der potente 5-LO-Inhibitor LP 119 mit einem IC50-Wert von 0,6 µM in intakten PMNL-Zellen identifiziert werden. Durch systematisches Durchsuchen virtueller Datenbanken konnten mindestens zwei Substanzen gefunden werden, die sowohl an intakten Zellen wie auch am partiell aufgereinigten Enzym die 5-LO-Aktivität hemmen, weitere Untersuchungen ergaben, dass es sich wohl zumindest bei einer Strukturklasse um einen direkten 5-LO-Inhibitor handelt.
  • 5-lipoxygenase catalyzes the first two steps in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes. 5-LO catalysis is regulated by Ca2+, phospholipids and the cellular redox tone. 5-LO consists of a catalytic domain and the N-terminal C2-like β-barrel domain. 5-LO activity requires oxidation of the ferrous iron in the active site to its ferric form. The C2-like domain binds Ca2+ and PC and mediates membrane binding. The aim of this study was to investigate 5-LO activation by the diacylglyceride OAG. Previous studies show agonist-induced 5-LO activity by OAG in intact cells, this induction is not connected with increased membrane translocation, phosphorylation or Ca2+-mobilization. Here is shown the direct stimulation of 5-LO by OAG in vitro. In the presence of 1 mM Ca2+, OAG caused no enhancement of 5-LO product synthesis in homogenates, S100 or purified 5-LO. Ca2+ was excluded from the incubations, resulting in up-regulation of 5-LO activity in S100 and purified 5-LO by OAG up to 8- and 14-fold at substrate concentrations under 20 µM AA. Other diacylglycerides such as DOG, OG and EAG caused 5-LO stimulatory effects in a dose-dependent manner, SAG failed to stimulate 5-LO. OAG reverse 5-LO inhibition by glutathione peroxidase (GPx) activity, DOG, OG, EAG and partially SAG do also. Thus, OAG mimics the stimulatory effects of Ca2+ in vitro, it enhances 5-LO at low substrate concentrations and renders 5-LO activity resistant against inhibition by GPx activity. This effects may be due to an increased affinity of the enzyme to its substrate and to a reduced requirement of 5-LO for activating lipid hydroperoxides. OAG still activates the loop2 mut-5LO, lacking the ability to bind Ca2+, so interactions at this binding site can be excluded. In S100 and purified 5-LO, phospholipids abolish the increase of 5-LO product synthesis by OAG, endogenous phospholipids prevent the stimulatory effects in homogenates. It appeared possible that OAG acts via the putative phospholipid binding site presented by tryptophan residues Trp-13, -75 and -102, mutation of these three residues to Alanin (3W mut-5LO) abolishes the effects of OAG on 5-LO. Also, OAG partially restored 5-LO activity in the presence of Hyperforin, a 5-LO inhibitor shown to act via the phospholipid binding site. Next, a lipid protein overlay assay for 5-LO was established, but thus far, no direct binding can be shown. In MM6 cells (serum free cultivated), BL41-E95-A cells, transfected HeLa cells and for soybean LO, 5-LO catalysis is not stimulated by OAG. For higher amounts of C2-like domain (MBP fusion protein, MBP-5LO1-128), an inhibitory effect on 5-LO activity was shown by reducing 5-HPETE. Interestingly, in presence of MBP-5LO1-128, a further increase of OAG-induced 5-LO activity is found, even at higher concentrations of MBP-5LO1-128. These results are well explained by reduced requirement of 5-LO for hydroperoxides, reduced quantities of 5-HPETE are sufficient for activation. Looking at 5-HETE/5-HPETE-ratio, addition of OAG in absence of Ca2+ at 10 µg MBP-5LO1-128 leads to a decrease of 5-HETE. Another aim of this study was to identify new 5-LO inhibitors. Systematic profiling of pirinixic acid leads to the potent suppressor of 5-LO product formation LP 119 with a IC50 value of 0,6 µM in intact PMNL. Virtual screening of natural-product-derived combinatorial libraries leads to at least two new chemotypes exhibiting significant inhibition of 5-LO catalysis in cell-based and cell-free activity assay. Further investigations identified at least one novel chemotype as direct 5-LO inhibitor.

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Metadaten
Author:Christina HörnigGND
URN:urn:nbn:de:hebis:30-78150
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Dieter SteinhilberORCiDGND, Oliver WerzORCiDGND
Advisor:Oliver Werz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/08/10
Year of first Publication:2010
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2010/07/09
Release Date:2010/08/10
Tag:C2-ähnliche Domäne; Diacylglyceride; OAG
5-lipoxygenase; C2-like domain; diacylglycerides; phospholipids; regulation
GND Keyword:Lipoxygenase <5->; Enzymatische Regulation; Glutathionperoxidase; Phospholipide; Inhibitor
Page Number:119
HeBIS-PPN:225948680
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Pharmazie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht