Open Access

Christina Nordhammer

• Neuere Daten weisen p53 eine wichtige Rolle in der Verarbeitung von Mangelsignalen zu und deuten darauf hin, dass p53-abhängige molekulare Mediatoren des Warburg-Effektes Glukoseverbrauch und mitochondriale Funktion regulieren. Wir stellten deshalb die Hypothese auf, dass p53-wildtyp (p53wt) in Gliomzellen den metabolischen Bedarf reduzieren kann, der durch deregulierte Signaltransduktionsprozessen unter Mangelbedingungen zu Stande kommt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die shRNA-vermittelte p53-Gensuppression als auch die Temperatur-sensitive dominant-negative p53V135A Mutante in humanen p53wt-Gliomzellen Glukoseverbrauch und Laktatproduktion erhöht, den Sauerstoffverbrauch reduziert und den Hypoxie-induzierten Zelltod steigert. Überdies konnte beobachtet werden, dass eine zelluläre p53-Suppression die Expression von Synthesis of Cytochrome c Oxidase 2 (SCO2), eines Effektors, der in der Atmungskette benötigt wird, reprimiert. Die Restoration von SCO2 in p53wt-defizient-Zellen konnte Glukoseverbrauch, Laktatproduktion und Sauerstoffverbrauch wieder normalisieren, und vermittelte zugleich eine Resistenz gegenüber Hypoxie von Rotenone, einem Inhibitor des Komplex I der Atmungskette, abhängige Weise. Dies zeigte, dass die SCO2-vermittelten Effekte von einer intakten oxidativen Phosphorylierung abhängig waren. Schließlich vermittelte eine Gensuppression von SCO2 in p53wt-Gliomzellen eine Sensibilisierung dieser Zellen gegenüber moderater Hypoxie. Es konnte auch gezeigt werden, dass p53 und HIF-1alpha miteinander kooperieren, um SCO2 unter Hypoxie zu induzieren, was suggeriert, dass i) SCO2 ein neues HIF-1alpha Zielgen sein könnte und ii) SCO2 ein neues Zielprotein darstellen könnte, um Atmung und ROS-Prävention über HIF-alpha zu modulieren. Diese Befunde deuten darauf hin, dass Gliomzellen einen Nutzen aus dem Aufrechterhalten eines p53wt-Status erzielen können, da dies ihre Vulnerabilität gegenüber moderater Tumor-Hypoxie reduzieren kann, und dass dieser Effekt SCO2-vermittelt ist. Dennoch konnte die Sensitivität von p53wt-defizient-Zellen gegenüber hochgradiger Hypoxie-induziertem Zelltod nicht über die Effekte von SCO2 erklärt werden, da diese Oxidase ihre Funktionen nur unter ausreichend oxyschen Bedingungen erfüllen kann. Um die Mechanismen aufzuklären, die p53wt-Zellen vor hochgradiger Hypoxie Schutz verleihen, wurde die Rolle von TIGAR (Tp53 Induced Glycolysis and Apoptosis Regulator), eines weiteren kürzlich charakterizierten metabolischen p53-Zielgens, untersucht. TIGAR zeigt Ähnlichkeit mit der Fruktose-Bisphosphatase-2-Domäne des bifunktionalen Enzyms 6-Phosphofrukto-2-Kinase/Fruktose-2,6-Biphosphatase 2, und reduziert die intrazellulären Konzentrationen von Fruktose-2,6-Bisphosphat (FBP-2). FBP-2 ist ein Glykolyse-Regulator, der in höheren Konzentrationen die Glykolyse hemmt und den Pentose-Phosphat-Weg (PPP) induziert, was zu einer Verringerung der intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies-Konzentrationen (ROS) führt. Die Überexpression von TIGAR in p53wt-Zellen verstärkte die Glykolyse-Hemmung unter normoxischen Bedingungen und erlaubte oxidative Phosphorylierung als kompensatorischen metabolischen Mechanismus. Zudem förderte TIGAR die Expression von Lon, einer Protease, die Untereinheiten der Atmungskette modulieren kann, und zugleich als Radikalfänger fungiert. Jedoch reduzierte TIGAR die Expression von SCO2. Die Restoration von TIGAR in p53wt-defizient-Zellen konnte die Sensibilität gegenüber hochgradiger Hypoxie aufheben. TIGAR reduzierte auch die ROS-Menge und verringerte die Sensitivität gegenüber oxidativen Stress. Zugleich sensibilisierte die Gensuppression von TIGAR in p53wt-Gliomzellen diese Zellen vor hochgradiger Hypoxie. Zudem korrelierte die Expression von HIF-1alpha mit der TIGAR-Expression, was eine neue Rolle von HIF-1alpha in der Regulation des Hypoxie-induzierten Zelltodes und der Protektion vor ROS vermuten ließ. Die Expression der Transketolase-Like-1 (TKTL1), eines Isoenzym der Transketolase im Pentose-Phosphat-Weg, ist in vielen Tumoren hochreguliert. Es wurde spekuliert, dass TKTL1 Zellen Schutz vor oxidativem Zellstress vermitteln kann. Zugleich ist bekannt, dass TKTL1 mit hohen phospho-Akt-Mengen in Gliomen korreliert. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass TKTL1 ein indirektes p53-Zielgen ist, welches über TIGAR reguliert werden kann. Eine Suppression der TKTL1-Expression in TIGAR-exprimierenden Zellen konnte die über TIGAR vermittelten protektiven Effekte gegenüber endogenen ROS, oxidativem Stress und Hypoxie-induziertem Zelltod aufheben. Folglich wurde hier ein bis jetzt unbekannter Zusammenhang zwischen TIGAR, TKTL1 und HIF-1alpha entdeckt. Ebenso konnte eine TKTL1-Suppression mittels siRNA wie die TIGAR-Suppression die HIF1-alpha-Transaktivierungsfähigkeit reduzieren, was zu der Vermutung Anlass gab, dass TKTL1 HIF1-alpha unter Hypoxie reguliert.
• Recent work has demonstrated that p53 plays an important role in the processing of starvation signals and that p53-dependent molecular mediators of the Warburg effect regulate glucose consumption and mitochondrial function. We therefore hypothesized that the common presence of wild-type p53 (p53wt) in glioma cells serves to limit metabolic demands induced by deregulated signal transduction processes in the presence of hypoxia and nutrient depletion. This thesis reports that shRNA-mediated gene suppression of p53 as well as the mutant temperature-sensitive dominant-negative p53V135A increased glucose consumption and lactate production, decreased oxygen consumption and enhanced hypoxia-induced cell death in p53wt human malignant glioma cells. Furthermore, antagonism of p53 repressed Synthesis of Cytochrome c Oxidase 2 (SCO2), an effector necessary for respiratory chain function. A SCO2 transgene in p53wt-deficient cells reconstituted glucose consumption, lactate production and oxygen consumption as well as resistance towards hypoxia in a sensitive fashion to rotenone, an inhibitor of complex I of the respiratory chain, demonstrating that this effect was dependent on intact oxidative phosphorylation. Finally, gene suppression of SCO2 in p53wt glioma cells sensitized these cells towards moderate hypoxia. It was also revealed that p53 and HIF-1alpha cooperate to activate SCO2 under hypoxia, suggesting i) SCO2 as a new target gene for HIF-alpha and ii) a novel option to modulate respiration and ROS-prevention via HIF-alpha. These findings suggest that glioma cells may benefit from retaining p53wt status by reducing their vulnerability towards moderate tumor hypoxia and that SCO2 mediates this effect. Notwithstanding the effects of SCO2, the sensitivity of p53wt-deficient cells towards profound hypoxia-induced cell death could not be explained by SCO2, as this oxidase can only perform its function under oxygen availability. In order to elucidate the mechanisms governing protection against severe hypoxia in p53wt cells, the role of TIGAR (Tp53 Induced Glycolysis and Apoptosis Regulator), another recently characterized p53 metabolic target gene, was analyzed. TIGAR shares similarity with the fructose-bisphosphatase-2 domain of the bifunctional 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 2 enzyme and reduces the level of fructose-2,6-bisphosphate (FBP-2). FBP-2 is a glycolysis regulator which at higher concentrations inhibits glycolysis and activates the pentose phosphate way (PPP), decreasing intracellular levels of reactive oxygen species (ROS). The overexpression of TIGAR in p53wt cells enhanced glycolysis inhibition under normoxia and allowed oxidative phosphorylation as a compensatory metabolic mechanism. Furthermore, TIGAR potentiated expression of Lon, a protease that modulates subunits of the respiration chain and acts as a ROS-scavenger, but decreased expression of SCO2. Restoration of TIGAR in p53wt-deficient cells could reverse sensitivity against severe hypoxia. TIGAR also lowered ROS levels and decreased sensitivity against oxidative stress. Additionally, gene suppression of TIGAR in p53wt glioma cells sensitized these cells towards profound hypoxia. Expression of HIF-1alpha also correlated with TIGAR-expression, suggesting a new role of HIF-1alpha in the regulation of hypoxia-induced cell death and protection against ROS. Transketolase-Like-1 (TKTL1), an isoenzyme of transketolase, an enzyme of the pentose phosphate way, is known to be upregulated in many tumors. It has been suggested that TKTL1 protects cells against oxidative stress and it is assumed to correlate with high phospho-Akt levels in Glioma. It is demonstrated herein that TKTL1 is an indirect p53 target gene that can be regulated via TIGAR. Suppressing TKTL1-expression in TIGAR-expressing cells also abolished the protecting effects of TIGAR towards endogenous ROS, oxidative stress and hypoxia-induced cell death. We have therefore elucidated a hitherto unknown link between TIGAR, TKTL1 and HIF-1alpha. Likewise, downregulation of TKTL1 by siRNA similar to TIGAR-suppression reduced HIF1-alpha-transactivation, suggesting a role of TKTL1 in the regulation of HIF1-alpha under hypoxia.