NMR investigation of cell-free expressed membrane proteins

  • In this thesis, the structure of the C-terminal domain of presenilin-1, the catalytic component of the y-secretase complex, is investigated by NMR spectroscopy. The ysecretase complex has a definitive role in the pathogenic development of Alzheimer's disease, in that it mediates the cleavage of aprecursor to create the amyloid ß peptide. Aggregates of amyloid ß which form amyloid plaques are the most overt clinieal feature observed in the post-mortem brains of Alzheimer's patient. In addition, many of the mutations found in the aggressive early onset familial Alzheimer's disease have been linked to presenilin-1, highlighting its importance in disease progression and deeming it an important target for investigation. One of the greatest challenges for the structural investigation of the y-secretase components is their low expression yields in cell-based systems. We therefore applied continuous-exchange cell-free expression to obtain sufficient amounts of protein for our structural studies. An added benefit of the cell-free expression system is the freedom to incorporate any desired combination of stable-isotope labels directly into sampies. We were therefore able to develop a labeling scheme which targets the amino acid composition of transmembrane a-helices, allowing us to simplify an assignment procedure whieh tends to be cumbersome and diffieult for most a-helical transmembrane proteins. The y-secretase complex is a member of the intramembrane cleaving proteases which, as their name implies, cleave their transmembrane substrates within the bilayer. Single particle analysis of the y-secretase (1) as weil as crystal structures of rhomboid (2) and S2P (3) have revealed the presence of hydrophilie po res within the membrane where catalysis occurs. In light of evidence that certain elements of CTF reside in close proximity or even contribute to the formation of the hydrophilic pore, we chose to study the structure of CTF in mieelles, whieh may be better suited to accommodate CTF in isolation as compared with solid membranes in the absence of the other y-secretase components. The structure of CTF was solved to 1.7 A (backbone r.m.s.d) and revealed the presence of unusual features, including a partially membrane-spanning helix which situates the catalytic asparte at its N-terminus in what would be the center of the membrane where catalysis is proposed to occur, as weil as a severely kinked helix which is partially embedded beneath the surface of the membrane (P6). Interestingly, similar features have been observed in the crystal structure of the GlpG rhomboid. In addition, a soluble helix was found in the long N-terminal loop of CTF which until now has been described as unstructured. The first part of the thesis is designed to provide an introduction to Alzheimer's disease, the role of y-secretase and its presenilin-l catalytic component in disease progression, as weil as cell-free expression and liquid-state NMR techniques involved in the structural investigation of membrane proteins. In chapter 2, the reader is familiarized with the history, the clinical manifestation, and biochemical features of Alzheimer's disease. The chapter goes further to describe the role of the y-secretase complex and its individual components in disease progression and substrate processing. Chapter 3 focuses more specifically on presenilin-l in the context of the newly emerging class of intramembrane proteases. In chapter 4, attention is shifted to the cell-free expression system with special focus on the expression of membrane proteins, and chapter 5 explores the various liquid-state NMR techniques that were required for the characterization of CTF. The second part of the thesis is cumulative and contains original research, method, and review articles that were produced during the course of study. Chapter 6 explores the various techniques and innovations used to study membrane proteins using continuous exchange cell-free expression coupled with NMR spectroscopy. In chapter 7, a new technique, transmembrane segment targeted labeling, is described as a tool that facilitates the backbone assignment of transmembrane proteins which display severe overlap in NMR spectra. Chapter 8 presents the novel NMR structure of the C-terminal fragment of presenilin-l solved in SOS micelles.
  • Die folgende Arbeit behandelt die strukturelle Untersuchung des C-Terminalen Fragments von Presenilin-l mittels NMR-Spektroskopie. Es stellt die katalytische Komponente des ySekretase-Komplex dar, welcher eine definierte Rolle in der pathogenen Entwicklung der Alzheimerschen Krankheit spielt, da es die Spaltung eines Vorläufer-Peptides zum Amyloid-ß (Aß) vermittelt. Aggregate des Amyloid-ß, welche Amyloid-Plaques ausbilden, sind der offensichtlichste pathologische Befund in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten. Viele Mutationen, die mit der familiären Alzheimerschen Krankheit assoziiert sind, wurden mit Presenilin in Zusammenhang gebracht. Diese Tatsache hebt die wichtige Bedeutung von Presenilin im Verlauf dieser Krankheit hervor und macht es zu einem interessanten Zielobjekt für eine genauere Untersuchung. Die größte Herausforderung der strukturellen Untersuchung von y-Sekretase Komponenten ist ihre geringe Expressionsrate in zell-basierten Systemen. Daher haben wir ein "continous exchange cell free"-System verwendet um ausreichende Proteinmengen für die strukturelle Untersuchung zu erhalten. Ein weiterer Vorteil der zellfreien Proteinexpression ist die Möglichkeit jederzeit beliebige Kombinationen von stabilen Isotopen zu den Ansätzen hinzufügen zu können. Im Vergleich mit der zell-basierten Expression bietet die zell-freie Expression daher den Vorteil, Probleme wie die Abhängigkeit von der Verfügbarkeit auxotropher Mutanten und metabolisches "scrambling" zu umgehen. Diese Tatsache ist besonders interessant für die Untersuchung von a-helikalen Membranproteinen, deren NMR-Spektren typischerweise durch starke Linienverbreiterung und spektrale Überlappung geprägt sind und daher stark von selektiven Isotopen-Markierungen profitieren. Um die sequenzielle Zuordnung der Rückgrad-Reste zu vereinfachen, haben wir die "transmembrane segment enhanced" (TMS) -Markierungsmethode entwickelt (PS). Diese Strategie beinhaltet die selektive 15N/13C Isotopen-Markierung von sechs Aminosäuren (A, F, G, I, L, V), welche typischerweise 60 % der Reste ausmachen, die in Transmembranregionen vorliegen. Somit lässt sich spektrale Überlappung signifikant verringern ohne jedoch sequenzielle Verknüpfungen zu verlieren, die essentiell für die Zuordnung von Rückgrad-Resten mittels 3D Experimenten wie des HNCA sind. Dadurch wird die Zuordnungs-Prozedur vereinfacht, welche sehr langwierig und schwierig für die meisten a-helikalen Membranproteine ist. .... Röntgenkristallographische Untersuchungen der "site-2-protease" und "rhomboid" beide Mitglieder der ";ntramembrane c/eaving protease"- Familie, zeigten außerdem, dass die aktiven Seiten in Wasser-gefüllten Aushölungen innerhalb der Lipid-Doppelschicht vorliegen. Aufgrund der Notwendigkeit einer mit Wasser gefüllten Aushölung für die katalytische Aktivität, wurde eine Mizelle als Umgebung für die Untersuchung von CTF gewählt. Eine flexiblere Mizelle könnte besser als eine solide Membran für die Untersuchung des CTF sein, da die anderen Komponenten der y-Sekretase fehlen, welche zur Ausbildung der hydrophilen Pore benötigt werden. Somit wurde in dieser Arbeit das CTF mittels NMR-Spektroskopie in einer SDS-Mizelle untersucht. Das größte Hindernis der Tertiärstrukturbestimmung von a-helikalen Membranproteinen ist die begrenzte Verfügbarkeit von NOE-basierten Abstandsinformationen. Diese ist in der Größe des Protein-Mizellen-Komplex begründet, welche eine Deuterierung erfordert, um die meisten Seitenketten-Protonen zu eliminieren. Selbst ohne Deuterierung würde die starke Resonanz-Überlappung in den Seitenketten-Regionen die NOE-Zuordnung stark erschweren. Um weitreichende Abstands-Beschränkungen zu erhalten, haben wir paramagnetic relaxation enhancement (PRE) verwendet. Mono-Cystein-Mutanten wurden hergestellt, indem die zwei nativen Cysteine des CTF zu Alaninen mutiert und einzelne Cysteine an 13 verschiedenen Positionen, in Loops und Helices, eingeführt wurden. Mithilfe von mit paramagnetischen MTSL markierten Proteinen konnten Distanzen nach der Methode von Battiste und Wagner (191) berechnet werden. Die Struktur des CTF wurde mit einer Genauigkeit von bis zu 1,7 A (Rückgrad r.m.s.d) gelöst und zeigt die Anwesenheit von sechs a-helikalen Regionen, von denen drei den Kern des Proteins formen (P6). Diese Struktur legt nahe, dass das CTF die Membran dreimal durchspannt, und stimmt somit mit den meisten akzeptierten CTF Topologiemodellen überein. Allerdings traten einige ungewöhnliche Aspekte auf, wie eine teilweise die Membran durchspannende Helix, welche das katalytische Aspartat N-terminal in der Mitte der Membran positioniert, wo die Katalyse stattfinden soll. Außerdem trat eine geknickte Helix auf, welche teilweise unter der Oberfläche der Membran eingebettet liegt. Interessanterweise wurden ähnliche Besonderheiten in der Kristallstruktur des GlpG ,rhomboids' gefunden. Weiterhin wurde eine lösliche Helix in dem langen N-terminalen Loops des CTF gefunden, welche bis zum jetzigen Zeitpunkt als unstrukturiert beschrieben wurde. Es wurden zusätzlich auch Experimente zur Untersuchung der Oberflächen-Zugänglichkeit und Dynamik der NMR-Struktur durchgeführt. Laut den Ergebnissen werden bestimmte a-helikale Elemente des CTFs tatsächlich einer hydrophilen Umgebung ausgesetzt. Dazu gehört auch die Helix, die das katalytische Aspartat enthält, welche nur teilweise in die Mizelle eingebettet ist. Währenddessen wird der katalytische Rest dem Lösemittel ausgesetzt, wie es für die Katalyse nötig ist. Unsere Daten der Oberflächen-Zugänglichkeit stimmten im Wesentlichen mit den Daten anderer Gruppen überein, welche im Kontext des aktiven y-Sekretase Komplex erhalten wurden (118-121). Im Allgemeinen deckt unsere Struktur ungewöhnliche Strukturmotive auf, welche möglicherweise gemeinsame adaptierte Besonderheiten in der Familie der "intramembrane c/eaving proteases" repräsentieren könnten. Die Existenz dieser Besonderheiten könnte auch die Schwierigkeit erklären eine Konsensustopologie des CTFs zu erhalten. Der erste Teil dieser Arbeit dient der Einführung in die Alzheimerschen Krankheit und in die Rolle der y-Sekretase und seiner Presenilin-1 katalytischen Komponente im Verlauf der Krankheit. Weiterhin wird die Zell-freie Expression und die Lösungs-NMR eingeführt, welche für die struktureille Untersuchung von Membranproteinen genutzt werden. Das Kapitel 2 macht den Leser mit der Geschichte, der klinischen Manifestierung und den biochemischen Besonderheiten der Alzheimerschen Krankheit vertraut. Weiterhin wird die Rolle des y-Sekretase-Komplexes und seiner individuellen Komponenten während des Krankheitsverlaufs und der Substrat-Prozessierung beschrieben. Das Kapitel 3 konzentriert sich spezifischer auf Presenilin-1 im Kontext der neu aufkommenden Klasse der "intremembrane cleaving proteases". Im Kapitel 4 wird die Aufmerksamkeit auf die Zell-freie Expression mit speziellem Fokus auf die Expression von Membranproteinen gelenkt. Das Kapitel 5 erkundet die verschiedenen Lösungs-NMR Techniken, welche für die Charakterisierung des CTFs benötigt wurden. Der zweite Teil dieser Arbeit ist kumulativ und beinhaltet ursprüngliche Forschung, Methoden und "review"-Artikel welche im Laufe der Studien entstanden sind. Das Kapitel 6 stellt verschiedene Techniken und Innovationen dar, die verwendet wurden um Membranproteine mit Hilfe der ,continuous exchange cell-free' Expression gekoppelt mit NMR-Spektroskopie zu untersuchen. In Kapitel 7 wurde eine neue Technik, das ,transmembrane segment targeted labefing' als Instrument zur Erleichterung der Rückgrad-Zuordnung von Transmembranproteinen durch Verringerung von spektraler Überlappung in NMR-Spektren, beschrieben. Das Kapitel 8 präsentiert die neue Struktur des Cterminalen Fragments von Presenilin-1, welche in SDS Mizellen gelöst wurde.

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Metadaten
Author:Solmaz Sobhanifar
URN:urn:nbn:de:hebis:30-93823
Referee:Volker DötschORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2011/03/29
Year of first Publication:2010
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Release Date:2011/03/29
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:42518286X
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
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