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Jan Hoffmann

• The analysis of biomolecular macrocomplexes requires certain preconditions to be fulfilled. The preparation of biomolecular samples usually results in low yields. Due to this constraint of low availability any method should provide a sufficient sensitivity to cope with typical sample amounts. Biomolecules also often show a reduced stability, i.e. a propensity for fragmentation upon ionisation, which requires reasonable soft methods for the investigation. Furthermore macromolecular complexes usually are composed by means of non-covalent interactions presenting additional demands on the softness. This holds true for specific complexes like protein-ligand or DNA double strand binding. For the formation of non-covalent, specific complexes the biomolecules’ native structure and environment are a basic prerequisite and hence crucial. Therefore it is desirable during analysis to keep the biomolecules in a native environment to preserve their structure and weak interactions. One suitable method for analysing biomolecules is mass spectrometry. Mass spectrometry is capable of high throughput screening as well as determining masses with high accuracy and high sensitivity. Especially since the availability of MALDI-MS and ESI-MS mass spectrometry evolved to a versatile tool to investigate biomolecular complexes. Both, MALDI- and ESI-MS are sufficiently soft methods to observe fragile biomolecules. Yet both methods have their advantages and disadvantages. During the recent years an alternative mass spectrometric approach has been developed in our group, termed LILBID-MS (Laser Induced Liquid Bead Ionisation/Desorption). In LILBID microdroplets of aqueous solution containing buffer, salt and further additives among the analyte molecules are injected into vacuum and irradiated one-by-one by mid-IR laser pulses. The absorption of the energy by the water leads to a rapid ablation of the preformed analyte ions. LILBID is highly tolerant for the addition of salts and detergents allowing to study biomolecular complexes in a native environment. As LILBID-MS is soft enough to avoid fragmentation, specific non-covalent complexes can be analysed directly from their native environment by this method. In addition dissociation can be induced on demand by increasing the laser intensity which allows for the study of subunit compositions. A further prominent property of LILBID is the possibility to study hydrophobic membrane proteins due to the tolerated use of detergents. During the course of this work, several instrumental improvements mostly concerning ion focussing and beam steering were introduced. Together with refinements of different modes of measurement the result is a significantly improved signal-to-noise ratio as well as a further improvement in sensitivity. In addition the accessible m/z range for a given flight time has been vastly increased. The new possibilities that LILBID now offers for the study of biomolecular complexes were investigated. The ability to detect specific binding in LILBID-MS was investigated by means of nucleic acids and their interaction with proteins. It could be shown that the stability of a 16bp dsDNA corresponds to that in solution phase regarding the dependency on concentration and type of the salts used. In addition a competitive experiment with the well-known transcription factor p50 was used to demonstrate the detection of sequence-specific binding with LILBID. The improved sensitivity allowed to detect single stranded DNA at nanomolar concentrations and even the 2686bp plasmid pUC19 could be easily detected without fragmentation using a concentration of only 80nM. In case of the transcription factor p63 the mass spectrometric analysis could help to identify a new model of activation and inhibition. For the first time known quarternary structures of membrane proteins like the light-driven proton pump bacteriorhodopsin and the potassium channel KcsA could be detected with mass spectrometry. For the light-driven proton pump proteorhodopsin the type and the concentration of the used detergents significantly influenced the stability of this protein as well as the preferred quarternary structure.
• Massenspektrometrie ist eine wichtige Methode zur Charakterisierung von Biomolekülen, mit der unter anderem die Sequenz, quartäre Struktur, Konnektivität von Untereinheiten und Komplexierungen mit Liganden bestimmt werden können. Eine besondere Herausforderung dabei ist der schonende Transfer der Molekülionen von der flüssigen in die Gasphase. Als schonende Verfahren für massenspektrometrische Untersuchungen an Biomolekülen haben sich ESI und MALDI etabliert. Seit einigen Jahren wird in der Arbeitsgruppe von Prof. Brutschy ein alternatives Verfahren mit dem Namen LILBID (Laser Induced Liquid Bead Ionisation/Desorption) entwickelt. In LILBID werden die zu analysierenden Moleküle mittels eines IR-Lasers direkt aus wässrigen Lösungen desorbiert. LILBID stellt eine komplementäre massenspektrometrische Methode zu ESI und MALDI dar, da sie besonders für den Nachweis von sehr großen, nichtkovalenten Komplexen, insbesondere von Membranproteinen, geeignet ist. Am Beispiel von doppelsträngiger DNA wurde der Nachweis spezifischer, nichtkovalenter Komplexe mit LILBID charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Stabilität eines 16-mer Doppelstranges in Abhängigkeit von der Art und der Konzentration des verwendeten Salzes derjenigen in Lösung entspricht. Anhand des Transkriptionsfaktors p50 wurde in einem kompetitiven Experiment der Nachweis der Bildung sequenzspezifischer Komplexe demonstriert. Instrumentelle Modifikationen am Massenspektrometer führten zu einer verbesserten Empfindlichkeit. So konnte ein DNA-Einzelstrang in einer Konzentration von 9 nM detektiert werden und für das 1,6 MDa Plasmid pUC19 wurde eine Konzentration von nur 80 nM benötigt. Darüber hinaus wurden spezifische Protein-RNA Komplexe untersucht. Im Fall von TAV 2B, einem Protein, dass RNA-Interferenz unterdrückt, konnte nachgewiesen werden, dass erst die Bindung an RNA eine Oligomerisierung des Proteins induziert. Am Beispiel der löslichen Proteine HvoLsm und p63 konnte gezeigt werden, dass die Wahl des Puffersystems entscheidend für die native Struktur ist. Im Fall des Transkriptionsfaktors p63 konnte erstmals ein Dimer nachgewiesen werden, der auf einen neuen Aktivierungsmechanismus beruht. Am Beispiel der lichtgetriebenen Protonenpumpe Bakteriorhodopsin und des Kaliumkanals KcsA wurden bekannte quartäre Strukturen von Membranproteinen erstmals massenspektrometrisch nachgewiesen. Für Proteorhodopsin wurde gezeigt, dass die Wahl des verwendeten Detergens maßgeblich die Struktur beeinflusst. Für den Ionenkanal Channelrhodopsin-2 wurde mit LILBID erstmals eine mögliche Stöchiometrie für den in Detergens gelösten Komplex gefunden. Schließlich wurde anhand einer F1Fo -ATP Synthase für Membranproteine gezeigt, wie die Wahl des Puffersystems die Komplexierung beeinflusst und dass diese Auswirkungen mit LILBID massenspektrometrisch nachgewiesen werden können.