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Markus Steber

• RNA hat neben der Rolle als Informationsüberträger wichtige Aufgaben in regulatorischen Prozessen. Sie kann komplexe Strukturen ausbilden und ähnlich wie Proteine Liganden binden oder enzymatische Reaktionen katalysieren. Im Rahmen dieser Arbeit sollten zwei Beispiele von RNA-Liganden-Interaktionen untersucht werden. Im ersten Abschnitt wurde die Interaktion des TetR-bindenden Aptamers 12-1 mit dem Tetracyclin-Repressorprotein (TetR) biochemisch charakterisiert. Über Gelverzögerungs- experimente wurde gezeigt, dass das Aptamer 12-1K delta A TetR mit hoher Affinität und Spezifität bindet. Es wurde ein KD von 22 nM bestimmt. Die Bindung ist dabei ebenso stark wie die Bindung von TetR an die Operatorsequenz tetO. In Anwesenheit von Tetracyclin (Tc) nimmt die Affinität des TetR/Aptamer-Komplexes um das sechsfache ab. Des Weiteren konnten die Bindeepitope des Aptamers durch eine Analyse von verschiedenen TetR-Mutanten im DNA-Bindebereich bestimmt werden. Die Aminosäuren T27, N47 und K48 sind dabei essentiell für die RNA-Bindung und führen bei einem Austausch zum Verlust der RNA-Bindung. Der Bindebereich des Aptamers überlappt mit Aminosäureresten, die für die tetO-Bindung essentiell sind. Die Stöchiometrie der TetR/Aptamer-Bindung wurde durch LILBID-Messungen auf eine molare Verteilung von 2:1 festgelegt. Ein TetR-Dimer bindet dabei ein Aptamermolekül. Durch die umfassende biochemische Analyse der TetR/Aptamer-Bindung kann das Aptamer 12-1 nun als Expressionssonde für RNAs in bakteriellen Zellen genutzt werden. Des Weiteren kann das Aptamer als alternativer, artifizieller Transkriptionsregulator im tet on / tet off-System verwendet werden. Im zweiten Teil der Arbeit sollten miRNAs identifiziert werden, die an der posttrans- kriptionellen Regulation der 5-Lipoxygenase (5-LO) und der Cyclooxygenase-2 (COX-2) beteiligt sind. Mit bioinformatischen Vorhersageprogrammen wurden die 3’-UTR- Bereiche von 5-LO und COX-2 nach putativen Bindestellen abgesucht. Im Fall der 5-LO wurden durch eine zusätzliche Microarray-Expressionsanalyse miRNAs ausgewählt, welche in 5-LO positiven Zellen hoch exprimiert sind und Bindestellen im 3’-UTR aufweisen. Es konnten verschiedene miRNAs detektiert werden, jedoch keine Regulation der 5-LO Aktivität beobachtet werden. Für COX-2 wurde neben der Suche nach putativen miRNA-Bindestellen zudem die Stabilität des 3’-UTR untersucht. Mit Hilfe des auf Perl basierenden Programms SignificanceScoreAssignment (Florian Groher, Diplomarbeit 2011) konnte der 3’-UTR von COX-2 als generell destabilisierend analysiert werden. In Colonkarzinom- spezifischen HT-29-Zellen wurden miRNAs untersucht, welche Bindestellen im 3’-UTR von COX-2 aufweisen. In diesem Kontext sollte der Einfluss einer Interaktion von HT- 29-Zellen mit aktivierten Thrombozyten sowie daraus isolierten Bestandteilen wie Mikropartikeln und PDGF analysiert werden. MiR-16, miR-26b, miR-199a und miR- 199a* konnten in HT-29-Zellen nachgewiesen werden. Bei einer Stimulation von HT-29- Zellen mit PDGF-BB werden miR-16 und miR-26b konzentrationsabhängig stärker exprimiert, während die Expression von miR-199a und miR-199a* signifikant abnimmt. Eine direkte Regulation von COX-2 durch die untersuchten miRNAs konnte durch Überexpressions- und Reportergenanalysen jedoch nicht festgestellt werden. Die Analysen der 5-LO- und COX-2-Regulation durch miRNAs stellen Vorarbeiten dar. Die etablierten Methoden können nun für eine detaillierte Betrachtung weiterer miRNAs verwendet werden.
• Besides the role as mediator of information RNA plays a crucial role in regulatory processes. RNA forms complex secondary structures in order to specifically bind ligands or to catalyze enzymatic reactions. In this present work two different RNA ligand interactions were analyzed. In the first project, a TetR binding aptamer interaction with the bacterial tetracycline repressor (TetR) protein was mechanistically characterized. The binding affinity between aptamer and TetR was determined by EMSA studies and showed similar nanomolar dissociation constants as the complex of TetR and its tet operator DNA. In presence of tetracyline the affinity between RNA aptamer and TetR drastically decreases by one order of magnitude . The positions T27, N47 and K48 could be determined as important binding epitopes. Mutants showed loss of function phenotypes in binding studies. A competitive binding model of TetR, aptamer and tetO DNA can be proposed lacking further structural information. Furthermore, LILBID mass spectroscopy analysis showed a 2:1 binding stoichiometry of a stable TetR dimer with one aptamer molecule. In conclusion, the TetR aptamer interaction can be used as an expression tag in bacterial cells and as an alternative transcriptional tet on / tet off activator in eukaryotic cells. In the second part, an analysis of 5-lipoxygenase (5-LO) and cyclooxygenase-2 (COX-2) regulating miRNAs was performed. Bioinformatical prediction algorithms showed putative miRNA binding sites of both 5-LO and COX-2 3’-UTR. An additional expression analysis with microarray technique showed highly expressed miRNAs in 5-LO positive cells. Different analysed miRNAs showed no regulatory effects on the 5-LO expression. The 3’-UTR stability of COX-2 could be determined due to its distribution with the Perl based SignificanceScoreAssignement software (Florian Groher, diploma thesis 2011). The COX-2 3’-UTR generally destabilized the mRNA showing a lot of AU rich elements. In coloncarzinoma cells HT-29 co-cultured with platelets the expression of miR-16, miR-26b, miR-199a and miR-199a* could be dectected by Northern blots and qRT-PCR. Microparticles isolated from platelets showed also miRNA expression. The COX inducing growth factor PDGF influenced dose dependent the increase of miR-16 and miR-26b and an significant decrease of miR-199a and miR-199a*. COX-2 directly regulation by miRNAs could not be detected with overexpression and reporter gene analysis. The established methods could be used for further investigations of miRNA regulation networks.