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Stefanie Koller

• Mesenchymale Stromazellen stellen derzeit eine der vielversprechensten Zellpopulationen dar und werden in Hinblick auf ihre zahlreichen Fähigkeiten und Eigenschaften intensiv erforscht. In dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf das für die Behandlung von immunvermittelten Erkrankungen wertvolle immunmodulatorische Potential der mesenchymalen Stromazellen. Dieses ist für standardmäßigplastikadhärent isolierte MSCs vielfach belegt. Der große Nachteil dieser Isolierungsmethode jedoch, ist die Gewinnung nur sehr heterogener Zellpopulationen, was das klonogene, proliferative und möglicherweise auch immunsuppressive Potential dieser Zellen betrifft. Deshalb schien es uns sinnvoll, die Eigenschaften mesenchymaler Stromazellen zu untersuchen, welche nach einer alternativen Selektionsprozedur, die sich des Oberflächenmarkers CD271 (LNGFR) bedient, und homogenere Zellpopulationen von MSCs hervorbringt. Den auf diese Art isolierten und angereicherten MSCs wird in der Literatur bereits ein erhöhtes klonogenes und proliferatives Potential bescheinigt, welches wir im Rahmen dieser Arbeit überprüften und schließlich auch bestätigen konnten. Im Zentrum dieser Dissertation standen jedoch Untersuchungen zum immunsuppressiven Potential dieser alternativselektierten MSCs, welches bis Dato noch nicht erforscht war. Zur Beantwortung der Frage, ob CD271-selektierte MSCs ein vergleichbares oder möglicherweise durch ihre Homogenität erreichtes, verbessertes immunsuppressives Potential auf Immunzellen entfalten, kultivierten wir diese Zellen mit auf unterschiedliche Weise stimulierten PBMNCs und evaluierten darunter deren Proliferationspotential. Wir fanden heraus, dass CD271+-MSCs in bestimmten Konzentrationen ein im Vergleich mit PA-MSCs erhöhtes immunsuppressives Potential auf allogen stimulierte PBMNCs entfalten und dabei in keinem unserer Versuche den standardmäßig selektierten MSCs unterlegen waren. Bei einem Anteil von 50% MSCs an der Zellsuspension vermögen CD271+- MSCs die Proliferation in stärkerem Maße zu inhibieren, als es PA-MSCs tun. Werden MSCs und PBMNCs in gleichem Verhältnis kultiviert, unterscheidet sich das Maß der Inhibition durch die beiden Zelltypen nicht signifikant. Betrug der Anteil der eingesetzten MSCs an der Zellsuspension nur geringe 1%, stimulierten CD271+-MSCs nicht die Proliferation der Lymphozyten, während es unter dem Einfluss von PA-MSCs zu signifikanter Proliferationssteigerung kam. Insgesamt stellte sich das immunmodulatorische Potential der CD271+-MSCs, genau wie das der PA-MSCs als dosisabhängig dar. Je höher der MSC-Anteil an der Zellsuspension, desto höher war das Suppressionspotential auf die Lymphozytenproliferation. Vergleichbare Ergebnisse lieferten Versuche, in denen MSCs zusammen mit IL-2 stimulierten allogenen PBMNCs eingesetzt wurden, was beweist, dass CD271+-MSCs auch maximal stimulierte PBMNCs signifikant proliferativ hemmen können. In Versuchen mit mitogen stimulierten PBMNCs konnten wir nachweisen, dass CD271+-MSCs auch die Proliferation von zuvor mit PHA, ConA und IL-2 stimulierten PBMNCs inhibieren. Im Gegensatz zu PA-MSCs vermochten sie aber nicht, die proliferationsfördernde Wirkung des Staphylokokken-Enterotoxin-B (SEB) aufzuheben. Um den Mechanismen der immunsuppressiven Fähigkeit mesenchymaler Stromazellen näher zu kommen, untersuchten wir drei erst kürzlich beschriebene mögliche Mediatoren der MSCvermittelten Immunmodulation. Wir analysierten die Wirkung mesenchymaler Stromazellen auf regulatorische T-Zellen, auf die Produktion von PGE2 und NO. Unter der Präsenz der MSCs kam es in der Population der allogen-stimulierten PBMNCs zu keiner signifikanten Zu- oder Abnahme an regulatorischen CD4+/CD25+-Zellen. Innerhalb der Population der regulatorischen T-Zellen kam es jedoch unter dem Einfluss der CD271+-MSCs zu einer signifikanten Zunahme der primitiveren Subpopulation CD4+CD25+CD45RA+ T-regulatorischer Zellen, welcher in der Literatur eine robuste suppressive Aktivität nach in vitro-Expansion bescheinigt wird. NO konnten wir durch unsere Untersuchungen als möglichen Mediator der Immunmodulation ausschließen. Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede für den NO-Gehalt in PBMNC-Kulturen, die in Anwesenheit oder Abwesenheit von MSCs inkubiert worden waren. Auch NO-Blockierungsversuche erbrachten keinen Effekt auf die Zellproliferation. Jedoch fanden wir eine signifikant positive Korrelation zwischen der PGE2-Konzentration und dem inhibitorischen Effekt von CD271+-MSCs auf die Proliferation der PBMNCs. Dass das PGE2 in unseren Experimenten das wichtigste Vermittlermolekül des immunsuppressiven Effekts von CD271+-MSCs darstellt, konnten wir zusätzlich in Versuchen mit dem PGE2-Syntheseinhibitor Indomethacin beweisen. In Zusammenschau mit Daten anderer Arbeitsgruppen ist insgesamt die Schlussfolgerung zulässig, dass es sich bei der Immunmodulation durch MSCs um einen komplexen Mechanismus handelt, der sowohl lösliche Faktoren, als auch Immunzellen einschließt und welcher weiterer Erforschung bedarf. Anhand unserer Untersuchungen konnten wir zeigen, dass CD271-selektierte MSCs neben der verbessert klonogenen und proliferativen Aktivität eine teilweise erhöhte und mindestens ebenbürtige immunsuppressive Fähigkeit, verglichen mit den nach Standard angereicherten MSCs, aufweisen. Letztlich befürworten und bestärken unsere Ergebnisse einen Einsatz CD271-angereicherter mesenchymaler Stromazellen zur Behandlung immunvermittelter Erkrankungen und versprechen eine vielseitige Verwendung dieser Zellen in Zukunft. Die vorliegende Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag zur notwendigen Standardisierung und Weiterentwicklung der Gewinnung und Anreicherung funktionsfähiger mesenchymaler Stromazellen und zum sicheren und raschen Einsatz dieser Zellen im klinischen Gebrauch. Weil es sich bei den vorgestellten Ergebnissen allerdings ausschließlich um ex vivo Experimente handelt, sind weitergehende Untersuchungen im Tierexperiment notwendig.
• Mesenchymal stromal cells currently represent one of the most promising cell populations, being studied intensively in regard to their many skills and properties. In this study, we focused on the immunomodulatory potential of mesenchymal stromal cells, which is very valuable for the treatment of immune-mediated diseases. This has been proven for standard plasticadherent isolated MSCs documented multiplicatively. However, the major disadvantage of this method of isolation is the extraction of only very heterogeneous cell populations regarding the clonogenic, proliferative, and possibly immunosuppressive potential of these cells. Therefore it seemed useful to study the properties of mesenchymal stromal cells, which uses an alternative selection procedure that makes use of the surface marker CD271 (LNGFR), and generates more homogeneous cell populations of MSCs. Literature has already certified an increased clonogenic and proliferative potential to the MSCs having been isolated and enriched accordingly which we examined and were ultimately able to validate with this dissertation. Central to this thesis, however, was the analysis of immunosuppressive potential of these alternative-selected MSCs, which to date has not been explored. To answer the question whether CD271-selected MSCs develop a comparable or possibly, attained by their homogeneity, improved immunosuppressive potential in immune cells, we cultured these cells with a variety of ways including stimulated PBMNCs and evaluated their proliferation potential. We found that CD271+-MSCs in a certain concentration and in comparison with PA-MSCs unfold an increased immunosuppressive potential of allogeneic stimulated PBMNCs, while not being in an inferior position to any of the MSCs selected by default in our experiment. With a 50% share of MSCs in cell suspension, CD271+-MSCs are able to inhibit proliferation to a greater extent than PA-MSCs. If culturing MSCs and PBMNCs in the same proportion, there is no significant difference in the degree of inhibition by the two different cell types. The proportion of MSCs used in cell suspension only being a small 1%, CD271 did not stimulate proliferation lymphocytes, while being under the influence of PAMSCs, there was a significant increase of proliferation. Overall, the immunomodulatory potential of the CD271+-MSCs, as well as that of the PA-MSCs demonstrated themselves as dose-dependent. The higher the MSC’s share of the cell suspension, the higher the suppression’s potential on lymphocyte proliferation. Comparable results were provided by experiments in which MSCs together with IL-2 stimulated allogeneic PBMNCs were used, which proves that CD271+-MSCs can also inhibit maximum stimulated PBMNCs significantly proliferative. In experiments with mitogen stimulated PBMNCs we could demonstrate that CD271+-MSCs inhibit the proliferation of previously with PHA, ConA and IL-2 stimulated PBMNCs. But contrary to PA-MSCs they were unable to annul the proliferation supportive effect of staphylococcal enterotoxin B (SEB). In order to approach the mechanisms of the immunosuppressive ability of mesenchymal stromal cells in more detail, we examined three recently described potential mediators of the MSC-mediated immune modulation. We analyzed the effect of mesenchymal stromal cells to regulatory T-cells in the production of PGE2 and NO. In the presence of MSCs there was no significant increase or decrease in regulatory CD4+/CD25+ cells in the population of allogeneic-stimulated PBMNCs. However, under the influence of CD271+-MSCs within the population of regulatory T cells, there was a significant increase in the more primitive subpopulation of CD4+CD25+CD45RA+ T-regulatory cells, which literature certifies to be a robust suppressive activity after in vitro expansion. Through our analysis we were able to exclude NO as a possible mediator of immune modulation. There were no significant differences for the NO content in PBMNC cultures that had been incubated in the presence or absence of MSCs. Also NO-blocking experiments revealed no effect on cell proliferation. However, we found a significant positive correlation between PGE2 concentration and the inhibitory effect of CD271+-MSCs on the proliferation of PBMNCs. The fact that the PGE2 in our experiments represented the most important mediator molecule of the immunosuppressive effect of CD271+-MSCs in our experiments was additionally proven by trials with the PGE2 synthesis inhibitor Indomethacin. In synopsis with data of other groups, the conclusion is generally accepted that the immune modulation by MSCs is a complex mechanism including both soluble factors and immune cells and which requires further exploration. Based on our studies, we found that CD271-selected MSCs alongside the improved clonogenic and proliferative activity, compared to the enriched standard for MSCs activity, hold a partially increased and at least equal immunosuppressive ability. Ultimately, our results support and encourage the use of CD271-enriched mesenchymal stromal cells for the treatment of immune-mediated diseases, and promise a varied use of these cells in the future. The present work makes an important contribution to the necessary standardization and development of the extraction and enrichment of functional mesenchymal stromal cells and for the safe and expeditious application of these cells in clinical use. However, the presented results only being ex vivo experiments, further studies through animal experiments are necessary.