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Nina Großmann

• The adaptive immune system protects against daily infections and malignant transformation. In this, the translocation of antigenic peptides by the transporter associated with antigen processing (TAP) into the ER lumen is an essential step in the antigen presentation by MHC I molecules. The heterodimeric ATP-binding cassette transporter (ABC) TAP consist of the two halftransporters TAP1 and TAP2. Each monomer contains an N-terminal transmembrane domain (TMD) and a conserved C-terminal nucleotide-binding domain (NBD). Together, the TMDs build the translocation core and the NBDs bind and hydrolyze ATP, energizing the peptide transport. TAP features an asymmetry in the two ATP-binding sites that are built of several conserved motifs. One motif is the D-loop with the consensus sequence SALD. The highly conserved aspartate of the D-loop of TAP1 reaches into the canonic ATP-binding site and contacts the Walker A motif and the H-loop of the opposite NBD, while the Asp of D-loop of TAP2 is part of the non-canonic ATP-binding site. To examine this ABC transport complex in mechanistic detail, a purification and reconstitution procedure was established with the function of TAP being preserved. The heterodimeric TAP complex was purified via a His10-tag at TAP1 in a 1:1 ratio of the subunits. Nucleotide binding to the purified transporter was elucidated by tryptophan quenching assays and the affinity constants for MgADP and MgATP were determined to be 1.0 μM and 0.7 μM, respectevely. In addition, the TAP complex shows strict coupling between peptide binding and ATP hydrolysis, revealing no basal ATPase activity in the absence of peptides. Furthermore, TAP was reconstituted into proteoliposomes and the activity was tested by peptide transport and ATP hydrolysis. Interestingly, the kinetic parameters of the transporter in the reconstituted state are comparable to the data gained for TAP in microsomes. To characterize the functional importance of the D-loop, D-loop mutants of either TAP1 or TAP2 were analyzed. Strikingly, TAP containing a mutated D-loop in TAP1 (D674A) shows an ATP-hydrolysis independent peptide translocation. Accordingly, the MHC I surface expression is similar to the wildtype situation. However, the same mutation in TAP2 (D638A) results in an ATPase dependent peptide transport similar to wildtype, whereas TAP containing mutations in both subunits leads to an inactive transporter. Although all D-loop mutants showed no altered peptide binding activity, the TAP1 mutant is inactive in peptide-stimulated ATPase activity. Strikingly, ATP or ADP binding is strictly required for the peptide translocation. Experiments carried out in proteoliposomes demonstrate that wildtype TAP can export peptides against their gradient when low peptide concentrations are offered. In contrast, the D674A mutant can facilitate peptide translocation along their concentration gradient in the two directions. At high peptide concentrations, TAP is trapped in a transport incompetent state induced by trans-inhibition. In conclusion, a TAP mutant that uncouples solute translocation from ATP hydrolysis was created. Since this passive substrate movement is strictly dependent on binding of ATP or ADP, an active transporter was turned into a “nucleotide-gated facilitator”. In a cysteine cross-linking approach the conformational changes of TAP during peptide transport and the flexibility of the nucleotide binding domains were examined. Single cysteines were introduced in the D-loops of TAP1 and TAP2. Cross-linking by copper-phenantroline (CuPhe) was possible for all combinations. However, by adding ATP, ADP or peptide to the TAP complex no differences in the cross-linking efficiency were detected. By CuPhe cross-linking TAP was trapped in a conformation, in which the peptide binding site was not accessible. To complete a transport cycle, a flexibility of at least 17.8 Å of the NBDs is needed, since TAP cross-linked by CuPhe (2.0 Å) or bismaleimidoethane (BMOE, 8.0 Å) was transport inactive but when TAP was cross-linked by 1,11-bismaleimido-triethyleneglycol (BM[PEG]3, 17.8 Å) transport activity was preserved.
• Der Transporter assoziiert mit Antigenpräsentation TAP (transporter associated with antigen processing) spielt eine Schlüsselfunktion in der adaptiven Immunantwort. Im Zytosol werden fehlgefaltete oder unvollständig translatierte Proteine ubiquitinyliert und später vom Proteasom degradiert. Einige dieser antigenen Peptide werden durch TAP erkannt und in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) transportiert. Dort werden sie auf Moleküle des Hauptkompatibilitätskomplexes I (major histocompatibility complex I, MHC I) geladen. Die Beladung des MHC I wird durch die Proteine des Peptidbeladungskomplexes (PLC) assistiert. Beladene MHC I-Moleküle gelangen schließlich über den klassischen sekretorischen Weg an die Zelloberfläche. Die Zelloberfläche wird kontinulierlich von zytotoxischen T-Zellen inspiziert. Erkennt eine zytotoxische T-Zelle ein beladenes MHC I-Molekül, wird die T-zellvermittelte Lyse bzw. Apoptose ausgelöst. TAP ist ein Mitglied der Familie der ABC-Transporter (ATP-binding cassette), welche Substrate durch ATP-Hydrolyse transportieren. Das Substratspektrum der ABC-Transporter ist sehr vielfältig und reicht von Ionen (CFTR), Vitaminen (BtuCD) über Peptide (TAP) und sogar Proteine (HlyB). Einige Krankheitsbilder sind durch funktionsunfähige ABC-Transporter verursacht, wie zum Beispiel: zystische Fibrose oder Hypercholesterinamie. Alle ABC-Transporter zeichnen sich durch ihre typische Architekur aus, welche aus zwei Transmembrandomänen (TMD) und zwei Nukleotidbindedomänen (NBD) besteht. Die TMDs bilden die Translokationspore, während die NBDs ATP binden und für dessen Hydrolyse verantwortlich sind. TAP ist ein Heterodimer, bestehend aus TAP1 und TAP2. Jedes Monomer trägt am N-Terminus die hydrophobe TMD und am C-Terminus die zytolosische NBD. Die TMDs sind durch sechs α-Helices, welche die Kerndomäne bilden, und weiteren N-terminale Helices aufgebaut. Im Gegensatz zu den TMDs sind die NBDs innerhalb der ABC-Transporterfamilie hoch konserviert. Folgende Motive der NBDs sind essentiell für die Bindung und Hydrolyse von ATP: das Walker A-Motiv (GxxGxGKS/T, x repräsentiert eine beliebige Aminosäure), das Walker B-Motiv (ФФФФD, Ф repräsentiert eine hydrophobe Aminosäure), der Q-Loop und das H-Switch-Motiv, der C-Loop (ABC-Signature, LSGGQ) und der D-Loop (SALD). Die zwei ATP-Bindestellen werden durch die beiden NBDs zusammen an deren Berührungsfläche gebildet. Durch die ATP-Bindung dimerisieren die NBDs in einer sogenannten head-to-tail-Orientierung. Dabei wird eine ATP-Bindestelle durch den C-Loop und das Aspartat vom D-Loop der NBD1 und vom Walker A-, Walker B-Motiv und H-Loop der NBD2 gebildet. Die zweite ATP-Bindestelle wird durch die entsprechenden Motive der jeweils anderen Untereinheit gebildet. Eine Besonderheit von TAP besteht in der Asymmetrie der ATP-Bindestellen. Die kanonische ATP-Bindestelle weißt alle charakterischischen Motive auf. Im Gegensatz dazu ist die zweite ATP-Bindestelle degeneriert, d.h. der C-Loop in TAP2 (LSGGQ->LAAGQ), das Walker B-Motiv (ФФФФD->ФФФФE) und der H-Loop (H->Q) in TAP1 weichen von den konservierten Sequenzen ab. Biochemische Daten zeigen, dass die kanonische ATP-Bindestelle in TAP eine wesentliche Rolle in der ATP-Hydrolyse spielt, wobei die degenerierte ATP-Bindestelle eher nur eine regulatorische Funktion hat. Die zentrale Frage im Feld der ABC-Transporter ist das detaillierte Verständnis über den ATP-Hydrolyse-Zyklus sowie dessen Kopplung mit der Substrattranslokation. Durch die Strukturaufklärung von ABC-Transportern in den letzten Jahren kann ein allgemeiner Transportmechanismus vermutet werden: Die Bindung von ATP führt zur Umwandlung der dem Zytosol zugewandten Konformation zur nach aussen zugewandten Transporterstruktur wobei eine Substratlokalisation mit einhergeht. Die Hydrolyse von ATP bewirkt das Zurrückkehren in den Ursprungszustand des Transporters. Ziele meiner Doktorarbeit waren (i) die ATPase-Aktivität von TAP zu untersuchen und ein Rekonstitutionsprotokoll zu etablieren, (ii) die Funktion des D-Loops zu studieren und (iii) die Flexibilität von TAP während des Peptidtransportes zu analysieren. Um mechanistische Details des ABC-Transporters TAP zu untersuchen, war es zwingend notwendig ein Reinigungs- und Rekonstitutionsprotokoll zu entwickeln. Eine Reinigungsmethode bei der TAP in allen Schritten aktiv blieb, wurde von Dr. Meike Herget etabliert. Hier wurde TAP in Sf9-Zellen heterolog exprimiert, die ER-Membranen mit Digitonin solubilisiert und schließlich wurde der TAP-Komplex über einen Histidin-Tag an TAP1 durch eine Metall-Affinitätschromatographie gereinigt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass nach der Reinigung vom TAP-Komplex eine Stöchiometrie von 1:1 von TAP1 und TAP2 vorliegt. Mithilfe eines Tryptophanquenching-Experiments konnte in einem homogenen Bindungstest die Bindung von ATP an TAP nachgewiesen werden. Die Dissoziationskonstanten wurden für MgATP von 0.7 μM und MgADP von 1 μM im gereinigten Zustand gemessen. Die Titrationskurven mit ATP, die durch das Tryptophanquenching aufgenommen wurden, zeigen eine Sigmoidalität, was ein Hinweis für eine Koorperativität der ATP-Bindung ist. Durch einen Malachitgrün-Assay konnte eine peptidstimulierte ATPase-Aktivität nachgewiesen werden. In der Gegenwart von hochaffinem Peptid zeigte TAP eine starke Stimulation der ATPase-Aktivität. Interessanterweise wurde keine basale ATPase-Tätigkeit festgestellt, denn eine Mutante, die ATPase-inaktiv ist, zeigte das gleiche ATPase-Niveau, wie TAP ohne Zugabe von Peptid. Dies belegt die strikte Kopplung von ATP-Hydrolyse und Peptidbindung. Weiterhin konnte TAP funktional in Liposomen (polare E.coli/DOPC-Liposomen) rekonstituiert werden. Die Aktivität wurde mittels spezifischen Peptidtransport und peptidstimulierter ATPase nachgewiesen. Interessanterweise sind die Peptidaffinitäten im rekonstituierten Zustand und in ER-Membranen (KD,rekonstituiert = 0.3 ± 0.1 μM vs. KD,Membranen = 0.6 ± 0.2 μM) miteinander vergleichbar, wobei die Bindungsaffinität im gereinigten Zustand (KD,gereinigt = 1.3 ± 0.3 μM) geringer ist. Dies belegt die Wichtigkeit der Lipidumgebung für die Funktion von TAP. Als hochkonserviertes Motiv in den NBDs wurde der D-Loop bisher noch nicht untersucht. In einem Alanin-Scan wurde jede Aminosäure des D-Loops von TAP1 durch ein Alanin bzw. Serin ersetzt. Alle generierten Mutanten waren in Bezug auf Peptid- und ATP-Bindung funktionsfähig. Alle Mutanten transportierten vergleichbar gut zum Wildtyp. Überraschenderweise zeigte die D674A/wt-Mutante einen ATP-Hydrolyse unabhängigen Transport. Die Peptidtranslokation durch D674A/wt ist abhängig von der Nukleotidbindung. Sowohl die Bindung von ATP, AMP-PNP, als auch ADP trieben die Peptidtranslokation voran. Eine peptidstimmulierte ATPase-aktivität konnte jedoch ausgeschlossen werden, was die ATP-Hydrolyse unabhängigen Transportdaten verstärkt. Die gleiche Mutation in TAP2 zeigte keine veränderte Transportaktivität, jedoch eine TAP-Variante mit der Aspartatmutation in beiden Untereinheiten ist nicht transportfähig. Dieses Ergebnis unterstreicht die Unterschiedlichkeit der NBDs. Obwohl die ATP-Bindung und Hydrolyse wichtig für die Koordination der Vorgänge im Peptidbeladungskomplex sind, konnte keine veränderte MHC I–Oberflächenexpression, vermittelt durch D674A/wt, festgestellt werden. Im Gegensatz zu TAP-Wildtyp transportiert die D674A-Mutante Peptide entlang des Konzentrationsgradienten. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass TAP-Wildtyp ein aktiver Transporter ist und gegen einen Konzentrationsgradienten transportiert. Der durch aktiven Transport aufegbaute Gradient ist abhängig von der angebotenen Peptidekonzentration. Je niedriger die aussen angebotende Peptidkonzentration, desto höher ist der entstandene Gradient. Interessanterweise ist ein aktiver Transport in die Proteoliposomen nur bis zu einer inneren Peptidkonzentration von 16 μM möglich. Auch durch D674A/wt-Mutante kann nur eine Peptidkonzentration von 16 μM (innen) erreicht werden. Dieser Effekt kann nicht durch das Anreichern eines Protonen- oder Ladungsgradienten erklärt werden. Auch konnte eine nicht optimale Rekonstitutionseffizienz, durch welche eine Anreicherung bei 15 μM Peptid erklärt werden könnte, ausgeschlossen werden. Es scheint, dass TAP ab dieser Konzentration in einer transportunfähigen Konformation durch eventuelle Peptidbindung auf der ER-Seite arretiert ist, was einer Trans-Inhibition entsprechen würde. Es konnte gezeigt werden, dass der Peptidtransport durch TAP-Wildtyp in nur eine Richtung voran getrieben wird. Selbst bei sehr großen Peptidkonzentrationsunterschieden (z. B. 1 μM aussen versus 100 μM innen) konnte kein Peptidtransport mit dem Gradienten in die andere Richtung initiiert werden. Im Fall der D674A/wt-Mutante ist eine bidirektionale Peptidtranslokation entlang des Konzentrationsgradients beobachtet worden. Wenn in den Proteoliposomen eine höhere Peptidkonzentration vorliegt als ausserhalb, geschieht die Peptidtranslokation nach aussen. Wenn jedoch aussen eine höhere Peptidkonzentration vorhanden ist als innen, wird Peptid nach innen transloziert, bis ein Gleichgewicht zwischen Innen und Aussen eingestellt ist. In der Folgerung wurde eine Mutante generiert, welche Peptide ungekoppelt von ATP-Hydroslyse entlang des Konzentrationsgradienten transloziert. Da dieser Prozess von der Nukleotidbindung abhängig ist, wurde ein aktiver ABC-Transporter in einen Nukleotid-abhängigen Facilitator umgewandelt. Um die Bewegung der NBDs während des Peptidtransports genauer zu untersuchen, wurden Cystein-Quervernetzungsstudien durchgeführt. Bei diesem experimentellen Ansatz wurden Cysteine an bestimmten Stellen in den D-Loops im TAP-Komplex eingeführt und später quervernetzt. Durch diese Quervernetzungen war es möglich die Dynamik der NBDs einzuschränken. Desweiteren sollten über diesen experimentellen Ansatz eventuelle Unterschiede in der Transportbewegung zwischen TAP-Wildtyp und der D674A/wt-Mutante ermittelt werden. Da die D-Loops von TAP1 und TAP2 in der nach außen-gerichteten Konformation sehr eng benachbart sind und in der zum Zytosol gerichteten Konformation separiert sind, wurde dieser Bereich ausgewählt, um Cysteine zu vernetzen. Die Einzelcysteinmutanten waren alle aktiv in der Peptid- und ATP-Bindung. Desweiteren wurde für alle Varianten, bis auf die N505C/wt-Mutante, eine vollständige Transportaktivität gezeigt. Interessanterweise zeigten die Einzelcysteinmutanten in denen auch die D674A-Mutation vorlag einen ATP-Hydrolyse unabhängigen Peptidtransport. Es wurde jeweils eine TAP1- und eine TAP2-Einzelcysteinvariante zusammen exprimiert und mit Kupferphenanthrolin (CuPhe) oxidiert, um eine Quervernetzung zu induzieren. Es konnte eine Quervernetzung zwischen 15% bis 70% je nach Kombination der Mutanten erreicht werden. ATP, ADP oder Peptid zeigten keinen Einfluß auf die Quervernetzung. Interessanterweise wurde durch die Zugabe von Apyrase die Quervernetzung verhindert. Die gleichen Ergebnisse wurden mit der SC/SC-Mutante in Kombitation mit der D674A-Mutation erziehlt und somit konnten keine Schlüsse über eine veränderte Konformationsänderung während des Peptidransports festgestellt werden.