Open Access

Daniela Rübsamen

• The translation of mRNAs into proteins is an elaborate and highly regulated process. Translational regulation primarily takes place at the level of initiation. During initation the eukaryotic initiation factors (eIFs) form a complex that binds to the 5’end of the mRNA to scan for a start codon. Once recognized, the ribosome is recruited to the mRNA and protein synthesis starts. Initiation of translation can basically occur via two distinct mechanisms, i.e. cap-dependent and cap-independent that is mediated via internal ribosome entry sites (IRESs). The former is mediated by a 5’cap structure composed of a 7-methylguanylate which is added to every mRNA during transcription and recruits the initiation complex. IRES-dependent translation involves elements within the 5’untranslated region (UTR) of the mRNA that mostly bind IRES trans-acting factors (ITAFs) which associate either with the initiation complex or with the ribosome itself and consequently allow for internal initiation of translation. During tumorigenesis the demand for proteins is increased due to rapid cell growth, which consequently requires enhanced translation. Many factors that regulate translation are overexpressed in tumors. Moreover, signaling pathways that trigger translation or further hyperactivated by the surrounding tumor microenvironment. This environment is largely generated by infiltration of immune cells such as macrophages that secrete cytokines and other mediators to promote tumorigenesis. As the effects of inflammatory conditions on the translation of specific targets are only poorly characterized, my study aimed at identifying translationally deregulated targets during inflammation-associated tumorigenesis. For this purpose, I cocultured MCF7 breast tumor cells with conditioned medium of activated monocyte-derived U937 macrophages (CM). Polysome profiling and microarray analysis identified 42 targets to be regulated at the level of translation. The results were validated by quantitative PCR and one target - early growth response 2 (EGR2) - was chosen for in depth analysis of the mechanism leading to its enhanced translation. In order to identify upstream signaling molecules causing enhanced EGR2 protein synthesis the cytokine profile of CM was analyzed and the impact of several cytokines on EGR2 translation was examined. Preincubation of CM with neutralizing antibodies revealed that lowering interleukin 6 (IL-6) had only little effect, whereas depletion of IL 1β significantly reduced EGR2 translation. This finding was corroborated by the fact that treatment with recombinant IL-1β enhanced EGR2 translation to virtually the same extend as CM. Further experiments revealed that this effect was mediated via the p38-MAPK signaling cascade. Interestingly, I observed that the mTOR inhibitor rapamycin, which reduces cap-dependent translation, specifically stimulated EGR2 translation. This result argued for an IRES-dependent mechanism that might account for EGR2 translation. The use of bicistronic reporter assays verified this hypothesis. In line with the above mentioned results, CM, IL-1β and p38-MAPK induced EGR2-IRES activity. Since IRESs commonly require ITAFs to mediate translation initiation, the binding of proteins to the 5’UTR was analyzed using mass spectrometry. Among others, several previously described ITAFs, such as polypyrimidine tract-binding protein (PTB) and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (hnRNP-A1) were identified to directly bind to the EGR2-5’UTR. Furthermore, overexpression of hnRNP-A1 enhanced EGR2-IRES activity whereas a dominant negative form of hnRNP-A1 significantly decreased it, thus, showing its importance for EGR2 translation. In summary, my data provide evidence that EGR2 expression can be controlled by IRES-dependent translational regulation, which is responsive to an inflammatory environment. The identified mechanism may not be exclusive for one target but might be representative for gene expression regulation mechanisms during tumorigenesis. This is of special interest for the treatment of cancer patients and development of more specific therapies to reduce tumor outcome.
• Die Translation von mRNAs in Proteine ist ein komplexer Prozess, der aufgrund seines hohen Energieverbrauchs strikt kontrolliert wird. Die Regulation findet dabei primär auf Ebene der Translationsinitiation statt. Während der Initiation bilden die eukaryotischen Initiationsfaktoren (eIFs) einen Komplex, der an das 5’Ende der mRNA bindet und die 5’untranslatierte Region (UTR) nach einem Startcodon scannt, woraufhin die ribosomalen Untereinheiten an die mRNA rekrutiert werden. Die Ribosomen vermitteln dann die eigentliche Proteinsynthese. Grundsätzlich können zwei verschiedene Arten der Initiation unterschieden werden – die Cap-abhängige sowie die Cap-unabhängige, wobei letztere über sogenannte internal ribosome entry sites (IRESs) vermittelt wird. Bei ersterer bindet der Initiationskomplex an die Cap-Struktur der mRNA, die aus einem N-terminalen 7 Methylguanylat besteht. Bei der IRES-vermittelten Initiation bindet der Initiationskomplex oder auch die kleine ribosomale Untereinheit direkt innerhalb der 5’UTR an die mRNA, allerdings in 3’-Distanz zur Cap-Struktur. Während der Tumorentwicklung kommt es aufgrund des verstärkten Zellwachstums zu einem gesteigerten Bedarf an Proteinen und somit zu erhöhter Translation. Viele Faktoren, die die Translation regulieren, werden in Tumoren überexprimiert oder sind überaktiv. Bei der Aktivierung der entsprechenden Signalkaskaden spielt das Tumormilieu eine zentrale Rolle. Dieses wird insbesondere von Zellen des Immunsystems wie z.B. Makrophagen beeinflusst. Makrophagen setzen dabei Mediatoren frei, welche das Tumorwachstum begünstigen. Während tumorigene Expressionsveränderungen auf Transkriptionsebene bereits detailliert untersucht wurden, gibt es nur wenig Information über Translationsveränderungen spezifischer Proteine. Deswegen war es das Ziel dieser Studie translationell (de-)regulierte Proteine in der entzündungsinduzierten Tumorigenese zu identifizieren. Dafür kokultivierte ich MCF7 Brustkrebszellen mit konditioniertem Medium von ausdifferenzierten U937 Makrophagen (CM). Die Translationsveränderung in den Tumorzellen wurde mit Hilfe von Polysomenfraktionierungen überprüft. Durch eine aufbauende Mikroarray Analyse wurden 42 mRNAs identifiziert, die translationell reguliert wurden. Die Ergebnisse des Mikroarrays wurden anschließend durch quantitative PCR validiert und der Regulationsmechanismus eines Targets – early growth response 2 (EGR2) – im Detail analysiert. Dafür untersuchte ich den Einfluss verschiedener im CM vorhandener Zytokine auf die EGR2-Translation mittels neutralisierender Antikörper. Es stellte sich heraus, dass die Abreicherung von Interleukin 6 (IL-6) die EGR2-Translationsinduktion durch CM nur minimal verringerte, wohingegen eine Depletion von IL-1β diese signifikant inhibierte. Dieser Befund wurde dadurch unterstützt, dass eine Behandlung mit rekombinantem IL-1β eine ähnlich starke Induktion der EGR2-Translation bewirkte wie CM. Anschließende Untersuchungen ergaben, dass dieser Effekt durch die p38-MAPK Signalkaskade vermittelt wurde. Desweiteren wurde beobachtet, dass der mTOR-Inhibitor Rapamycin, der die Cap-abhängige Translation hemmt, ebenfalls zu einer verstärkten EGR2-Translation führte. Dies ließ vermuten, dass ein IRES-vermittelter Mechanismus der Translation von EGR2 zu Grunde lag. Durch die Verwendung von bicistronischen Reporter-Vektoren wurde diese Hypothese bestätigt. Außerdem konnte ich beweisen, dass CM, IL 1β und p38-MAPK die EGR2-IRES-Aktivität in der gleichen Art beeinflussten wie bereits für die EGR2-Translation mittels Polysomenfraktionierung gezeigt. Da zelluläre IRES-Elemente oft durch sogenannte IRES trans-acting factors (ITAFs) induziert werden, wurden mittels Massenspektrometrie Proteine identifiziert, die an die 5’UTR von EGR2 binden. Unter anderem wurden die bereits bekannten ITAFs polypyrimidine tract-binding protein (PTB) und heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (hnRNP-A1) gefunden. Abschließend konnte bewiesen werden, dass die Überexpression von hnRNP-A1 zu einer Erhöhung der EGR2-IRES-Aktivität führte, wohingegen eine dominant-negative Mutante von hnRNP-A1 diese signifikant inhibierte. Diese Ergebnisse ließen darauf schließen, dass hnRNP-A1 einen entscheidenden Einfluss auf die IRES-abhängige EGR2-Translation hat. Zusammenfassend konnte ich einen neuen Translationsregulationsmechanismus für EGR2 identifizieren, der durch ein entzündliches Tumormikroenvironment in Tumorzellen induziert wird. Dieser Mechanismus ist möglicherweise auch auf weitere translationell regulierte Targets übertragbar. Dies ist von besonderem Interesse, da es für eine optimale Behandlung von Tumorpatienten essentiell ist die zu Grunde liegenden Regulationsmechanismen zu verstehen.