Open Access

Kathrin Schulz

• In the absence of apparent mutations, alteration of gene expression patterns represents the key mechanism by which normal cells evolve to cancer cells. Gene expression is tightly regulated by posttranscriptional processes. Within this context, RNA-binding proteins (RBPs) represent fundamental factors, since they control mechanisms, such as mRNA-stabilization, -translation and -degradation. Human antigen R (HuR) was among the first RBPs that have been directly associated to carcinogenesis. HuR modulates the stability and translation of mRNAs which encode proteins facilitating various ‘hallmarks of cancer’, namely proliferation, evasion of growth suppression, angiogenesis, cell death resistance, invasion and metastasis. Furthermore, it is well established that tumor-promoting inflammation contributes to tumorigenesis. In this process, monocytes are attracted to the site of the tumor and educated towards a tumor-promoting macrophage phenotype. While HuR has been extensively studied in various tumor cell types, little is known about HuR in hepatocellular carcinoma (HCC). Thus, the aim of my work was to characterize the contribution of HuR to the development of cancer characteristics in HCC. I was particularly interested to investigate if HuR facilitates tumor-promoting inflammation, since a role for HuR has not been described in this context. To this end, I depleted HuR in HepG2 cells (HuR k/d) and used a co-culture model of HepG2 tumor spheroids and infiltrating monocytes to study the impact of HuR on the tumor microenvironment. I could show that depletion of HuR resulted in the reduction of cell numbers. Additionally, the expression of proliferation marker KI-67 and proto-oncogene c-Myc was reduced, supporting a proliferative role of HuR. Furthermore, exposure to cytotoxic staurosporine elevated apoptosis in HuR k/d cells compared to control cells. Concomitantly, the expression of the anti-apoptotic mediator B-cell lymphoma protein-2 (Bcl-2) was markedly reduced in the HuR k/d cells, pointing to an involvement of HuR in cell survival processes. Accordingly, a pro-survival function of HuR was also observed in tumor spheroids, since HuR k/d spheroids exhibited a larger necrotic core region at earlier time points and showed elevated numbers of dead cells compared to control (Ctr.) spheroids. Interestingly, HuR k/d spheroids isplayed reduced numbers of infiltrated macrophages, suggesting that HuR contributes to a tumor-promoting, inflammatory microenvironment by recruiting monocytes/macrophages to the tumor site. Aiming at identifying HuR-regulated factors responsible for the recruitment of monocytes, I found reduced levels of the chemokine interleukin 8 (IL-8) in supernatants of HuR k/d spheroids, supporting a critical involvement of HuR in the chemoattraction of monocytes. Analyzing supernatants of co-cultures of macrophages and HuR k/d or Ctr. spheroids revealed additional differences in chemokine secretion patterns. Interestingly, protein levels of many chemokines were elevated in co-cultures of HuR k/d spheroids compared to control co-cultures. Albeit enhanced chemokine secretion was observed, less monocytes are recruited into HuR k/d spheroids, further underlining the necessity of HuR in cancer related monocyte/macrophage attraction and infiltration. Differences between chemokine profiles of mono- and co-cultured spheroids could be attributable to changes in spheroid-derived chemokines as a result of the crosstalk with the immune cells. Provided the chemokines originate from monocytes/macrophages, the different secretion patterns suggest that HuR contributes to the modulation of the functional phenotype of infiltrated macrophages, since the tumorenvironment is critically involved in the shaping of macrophage phenotypes. Regions of low-oxygen (hypoxia) represent another critical feature of tumors. Therefore, I next analyzed the impact of HuR on the hypoxic response. Loss of HuR attenuated hypoxia-inducible factor (HIF) 2α expression after exposure to hypoxia, while HIF-1α protein levels remained unaltered. Considering previous results of our group, showing that HIF-2α depletion (HIF-2α k/d) resulted in the enhanced expression of HIF-1α protein, I aimed to determine the involvement of HuR in the compensatory upregulation of HIF-1α protein in HIF-2α k/d cells. I could demonstrate that not only total HuR protein levels, but specifically cytoplasmic HuR was elevated in HIF-2α depleted cells pointing to enhanced HuR activity. Silencing HuR in HIF-2α deficient cells attenuated enhanced HIF-1α protein expression, thus confirming a direct role of HuR in the compensatory upregulation of HIF-1α. This as also reflected on HIF-1α target gene expression. I further investigated the mechanism underlying the compensatory HIF-1α expression in HIF-2α deficient cells. Analyzing HIF-1α mRNA expression, I excluded enhanced HIF1-α transcription and stability to account for elevated HIF-1α expression in HIF-2α k/d cells. HIF-1α promoter activity assays confirmed the mRNA data. Furthermore, HIF-1α protein half-life was not elevated in HIF-2α k/d cells compared to control cells, indicating that HIF-1α protein stability is not altered in HIF-2α k/d cells. Analysis of the association of HIF-1α with the translational machinery using polysomal fractionation finally revealed an increased istribution of HIF-1α mRNA in the heavier polysomal fractions in HIF-2α k/d cells compared to control cells. Since augmented ribosome occupancy is an indicator for more efficient translation, I propose enhanced HIF-1α translation as underlying principle of the compensatory increase in HIF-1α protein levels in HIF-2α k/d cells. In summary, my results demonstrate that HuR is critical for the development of cancer characteristics in HCC. Future work analyzing the impact of HuR on tumor-promoting inflammation, specifically macrophage attraction and activation could provide new trategies to inhibit macrophage-driven tumor progression. Furthermore, I provide evidence that HuR contributes to the hypoxic response by regulating the expression of HIF-1α and HIF-2α. Targeting single HIF-isoforms for tumor therapy should be carefully considered, because of their compensatory regulation when one α-subunit is depleted. Thus, therapeutic strategies targeting factors such as HuR that control both α-subunits and at the same time prevent compensation might be more promising.
• Genetische Veränderungen bilden oft die Grundlage für die Entstehung von Tumoren. In vielen Fällen kann Krebs jedoch nicht direkt mit einem genetischen Defekt in Verbindung gebracht werden, sondern mit der Veränderung von Genexpressionsmustern. Die Genexpression unterliegt unter anderem der Kontrolle durch posttranskriptionelle Mechanismen. In diesem Zusammenhang spielen RNA-Bindeproteine eine zentrale Rolle, da sie Prozesse, wie mRNA-Stabilität, -Translation und -Abbau regulieren. Human antigen R (HuR) wurde als eines der ersten RNA-Bindeproteine direkt mit der Entstehung und der Progression von Tumoren in Verbindung gebracht, da HuR in vielen Karzinomen überexprimiert ist, wobei die HuR Menge mit voranschreitenden Tumorstadien korrelierte. HuR reguliert die Stabilität und Translation von mRNAs, die für Proteine kodieren, welche an der Entwicklung der so genannten „Hallmarks of Cancer“ maßgeblich beteiligt sind. Diese Tumoreigenschaften sind im Einzelnen: die Fähigkeit zur Angiogenese, Proliferation, Invasivität und Metastasierung sowie die Resistenz gegenüber wachstumshemmenden Faktoren und Zelltod. Zudem ist es weitgehend anerkannt, dass die tumorassoziierte Entzündung die Grundlage für viele dieser Eigenschaften bildet und somit entscheidend zur Tumorprogression beiträgt. Eine tumorassoziierte Entzündung ist vor allem durch die Präsenz von Immunzellen, insbesondere Makrophagen, im Tumorgewebe charakterisiert. Die Makrophagen werden durch tumorsezernierte Faktoren sowie das tumorumgebenden Mikromilieus rekrutiert und zu einem alternativen Makrophagen-Phänotyp umprogrammiert. Im Gegensatz zu den klassisch aktivierten Makrophagen, welche Tumorzellen bekämpfen, ist dieser alternative Phänotyp dadurch gekennzeichnet, dass er das Tumorwachstum fördert. Daher werden diese Makrophagen auch als tumorassoziierte akrophagen (TAM) bezeichnet. HuR wurde bereits in vielen Krebsarten detailliert untersucht und zum Teil sogar als prognostischer Marker etabliert. Für Lebertumore hingegen ist derzeit noch sehr wenig bekannt. Lebertumore werden meist erst diagnostiziert, wenn bereits Sekundärfolgen durch Organversagen oder Metastasierung eingetreten sind. Daher ist es essentiell, bessere prognostische Marker zu identifizieren und das Wissen über die Mechanismen der eberkarzinomentstehung zu vertiefen. Ziel meiner Arbeit war es daher den Einfluss von HuR auf die Entwicklung von tumorfördernden Eigenschaften und Fähigkeiten in Leberkarzinomen zu untersuchen. Von besonderem Interesse war hierbei die Frage, ob HuR einen Einfluss auf die Entstehung der tumorassoziierten Entzündung hat. Dazu habe ich HepG2 Hepatokarzinomzellen als Modellorganismus gewählt und die Expression von HuR mittels stabiler, lentiviraler Transduktion von short hairpin RNA reduziert. Die Kultivierung der Zellen als Tumorsphäroide ermöglichte es mir die drei-dimensionale Tumorentstehung in vitro zu studieren. Während der Analyse verschiedener Tumorzelleigenschaften konnte ich zeigen, dass der knockdown (k/d) von HuR zu einer Reduktion der Zellzahl führte. Zudem wiesen Zellen mit reduzierter HuR Expression (HuR k/d Zellen) signifikant weniger Expression des roliferationsmarkers KI-67 sowie des proliferativen Protooncogens c-Myc auf. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass HuR maßgeblich an der Förderung proliferativer Prozesse beteiligt ist. Untersuchungen der Zellvitalität ergaben, dass der Verlust von HuR zu einer verminderten Resistenz gegenüber der zytotoxischen Substanz Staurosporin führte. Dabei wiesen HuR k/d Zellen eine erhöhte Caspase-3 Aktivität auf, was als Hinweis auf einen gesteigerten apoptotischen Zelltod gewertet werden konnte. Zudem war die Expression des anti-apoptotischen Proteins B-cell lymphoma protein-2 (Bcl-2) in HuR k/d Zellen stark vermindert, was die erhöhte zytotoxische Sensitivität teilweise erklären könnte. In HepG2 Tumorsphäroiden führte der Verlust von HuR ebenfalls zur Ausbildung größerer nekrotischer Areale im Zentrum der Sphäroide. Diese Beobachtung konnte durch Kalkulation der toten Zellen (Propidiumiodid-positiv) mit Hilfe des Durchflusszytometers bestätigt werden, wobei die Anzahl der toten Zellen in HuR k/d Sphäroiden signifikant erhöht war. Insgesamt deuten meine Ergebnisse darauf hin, dass HuR entscheidend zur Zellvitalität beiträgt. Ein Kokulturmodell von Tumorsphäroiden mit primären, humanen Monozyten ermöglichte es mir, den Ablauf komplexer physiologischer Prozesse, wie die Einwanderung von Monozyten, bzw. Makrophagen zu studieren und Rückschlüsse über den Einfluss von HuR auf das Tumormikromilieu zu ziehen. Ich konnte zeigen, dass der Verlust von HuR zu einer verminderten Infiltration von Makrophagen in Tumorsphäroide führte. Bei der Identifikation der aktoren, die für die unterschiedliche Infiltration verantwortlich sein könnten, fand ich im Vergleich zu Kontroll-Sphäroiden verringerte Mengen des Chemokins Interleukin 8 (IL-8) in Überständen von HuR k/d Sphäroiden. IL-8 wurde bereits in früheren Arbeiten mit der Rekrutierung von Immunzellen in Verbindung gebracht und repräsentiert zudem ein bekanntes HuR Zielgen. HuR könnte also durch die Regulation von IL-8 initial zu der Einwanderung von Makrophagen beitragen. Darüber hinaus stellte ich bei der Analyse von Kokultur-Überständen ein verändertes Chemokinsekretionsprofil fest. Interessanterweise enthielten KokulturÜberstände von Monozyten mit HuR k/d Sphäroiden erhöhte Mengen an MCP-1, MIP-1α, MDC und Gro-α im Vergleich zu Kontroll-Kokulturen. Im Gegensatz dazu erschien die MIP-1β Sekretion leicht verringert. Obwohl die HuR k/d Kokulturen erhöhte Chemokinmengen aufwiesen, war gleichzeitig die Infiltration mit Makrophagen in die HuR k/d Sphäroide vermindert. Diese Beobachtung lässt die Schlussfolgerung zu, dass IL-8 einen maßgeblichen Einfluss auf die Rekrutierung von Monozyten ausübt. Die Chemokine in den Überständen der Kokulturen können einerseits von Monozyten, bzw Makrophagen stammen oder alternativ von den Sphäroiden sezerniert wordensein, die durch den Kontakt mit den Immunzellen zur Produktion unterschiedlicher Faktoren angeregt wurden. Sollten die Chemokine von den Immunzellen stammen, könnte die unterschiedliche Chemokinproduktion auf verschiedene funktionelle Makrophagen-Phänotypen in HuR k/d und Kontroll-Sphäroiden hindeuten, da die Polarisierung von Makrophagen stark vom jeweiligen Tumormikromilieu beeinflusst wird. Die Ergebnisse meiner Arbeit deuten darauf hin, dass HuR sowohl die Infiltration von Makophagen, als auch die Ausdifferenzierung des Makrophagen-Phänotyps reguliert. Insgesamt konnte ich zeigen, dass HuR nicht nur entscheidend an der Ausprägung von Tumoreigenschaften und -fähigkeiten in Hepatokarzinomzellen beteiligt ist, sondern auch das Tumormikromilieu beeinflusst. Sauerstoffmangel (Hypoxie) stellt eine weitere, wichtige Eigenschaft des Tumormikromilieus dar. Da die Sauerstoffversorgung über Diffusion limitiert ist, resultiert die Hypoxie in Tumoren dabei aus der Kombination von schnellem Wachstum und ungenügender Vaskularisierung. Aufgrund des Sauerstoffmangels akkumulieren die Transkriptionsfaktoren hypoxia-inducible factor (HIF) 1 und HIF-2, welche die zellulären Anpassung an Hypoxie steuern und somit entscheidend zur Steigerung des Tumorwachstums beitragen. Im zweiten Teil meiner Arbeit untersuchte ich den Einfluss von HuR auf die Adaption von Zellen an Hypoxie. Hierbei sollte speziell die Regulation der α-Untereinheiten von HIF-1 und HIF-2 durch HuR genauer untersucht werden. Ich konnte zeigen, dass der Verlust von HuR zu einer starken Verringerung der Expression von HIF-2α sowohl auf mRNA, als auch auf Proteinebene führte. Im Gegensatz dazu war die HIF-1α Expression unverändert, obwohl unsere Arbeitsgruppe bereits publiziert hat, dass der Verlust von HIF-2α (HIF-2 k/d) eine kompensatorische Erhöhung der HIF-1α Proteinexpression zur Folge hatte. Daher erstellte ich die Hypothese, dass HuR an der Induktion der HIF-1α Proteinexpression in HIF-2α k/d Zellen beteiligt ist. Initial untersuchte ich daher die HuR Proteinmenge und Lokalisierung in HIF-2α k/d Zellen. Dabei stellte sich heraus, dass sowohl die HuR Proteinexpression, als auch die Translokation von HuR vom Zellkern ins Zytoplasma in HIF-2α defizienten Zellen erhöht waren, was auf eine verstärkte HuR Aktivität hinwies. Um nun eine direkte Beteiligung von HuR bei der kompensatorischen Induktion der HIF-1α Proteinexpression in HIF-2α k/d Zellen zu untersuchen, reduzierte ich in letzteren die HuR Expression mittels small interfering RNA. Interessanterweise, führte die HuR Depletion dazu, dass die Proteinexpression von HIF-1α nicht mehr kompensatorsich erhöht wurde. Als Konsequenz kam es außerdem zu einer Reduktion der HIF-1α Zielgenexpression (z.B. Bcl-2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3 (BNIP3)), was die Rolle von HuR bei der Regulation hypoxischer Prozesse unterstreicht. Die kompensatorische Gegenregulation der HIF-α Untereinheiten wurde bereits in der Literatur beschrieben, jedoch ohne bislang eine mechanistische Erklärung zu liefern. Für mich war es daher von besonderem Interesse den Mechanismus aufzuklären, der zur verstärkten, HuR-abhängigen HIF-1α Expression in HIF-2α defizienten Zellen führt. Ein Vergleich der HIF-1α mRNA Expression in HIF-2α k/d und Kontrollzellen zeigte keine Veränderung der HIF-1α Transkription in HIF-2α defizienten Zellen. Untersuchungen der HIF-1α Promoteraktivität bestätigten die mRNA Daten. Auch eine erhöhte HIF-1α mRNA Stabilität konnte aufgrund von vergleichbaren HIF-1α mRNA Mengen in HIF-2α k/d und Kontrollzellen nach Transkriptionsinhibition ausgeschlossen werden. Eine Überprüfung der Proteinstabilität ergab weiterhin, dass nach Translationsinhibition keine Erhöhung der HIF-1α Protein Halbwertzeit in HIF-2α k/d Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen auftrat. Eine Analyse der Translation hingegen zeigte, dass in HIF-2α k/d Zellen signifikant mehr HIF-1α mRNA in den schweren, polysomalen Fraktionen detektiert werden konnte als in Kontrollzellen. Die vermehrte Bindung von Ribosomen an die HIF-1α mRNA weist dabei auf eine erhöhte HIF-1α Translationrate in HIF-2α k/d Zellen hin. Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass der Verlust von HIF-2α zu einer erhöhten Expression und zytoplasmatischen Lokalisierung von HuR führt, was wiederum zu einer verstärkten HIF-1α Expression beiträgt. Als bisher unbekannten Mechanismus für die verstärkte HIF-1α Proteinexpression in HIF-2α k/d Zellen konnte ich eine erhöhte Translation von HIF-1α ermitteln. Insgesamt zeigen meine Untersuchungen, dass HuR maßgeblich an der Entwicklung von Tumoreigenschaften in Leberkarzinomzellen beteiligt ist und somit eine Relevanz als prognostischer Marker für Leberkrebs aufweist. Ein detailliertes Verständnis des Einflusses von HuR in Tumoren auf die tumorassoziierte Entzündung und insbesondere die damit verbundene Rekrutierung und Aktivierung von Monozyten/Makrophagen, könnte einen Forschungsaspekt für neue therapeutischen Ansätzen darstellen. Darüber hinaus konnte ich nachweisen, dass HuR die Expression von HIF-1α und HIF-2α reguliert und somit die hypoxische Adaption von Zellen moduliert. Allgemein lässt sich schlussfolgern, dass Therapien, die die HIF Menge oder Aktivität nur einer Isoform reduzieren, aufgrund der beschriebenen kompensatorischen Regulationsmechanismen kritisch betrachtet werden sollten. HuR hingegen könnte ein viel versprechendes, übergeordnetes therapeutisches Ziel darstellen, da HuR die HIF-α Expression beider Isoformen kontrolliert und somit eine Kompensation verhindert.