Structural determinants for substrate specificity of the promiscuous multidrug efflux pump AcrB

  • Opportunistic Gram-negative pathogens such as Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter Baumanii and Pseudomonas aeruginosa are becoming more and more multiresistant against many commonly available antibiotics [39, 40]. An important resistance mechanism of Gram-negative bacteria is the efflux of noxious compounds by tripartite systems [39, 41-44]. The best studied and most clinically relevant tripartite system is the AcrA-AcrB-TolC system of Escherichia coli, where substrate recognition and energy transduction takes place in the inner membrane protein AcrB. AcrB has a remarkably huge substrate spectrum and can recognize structurally diverse molecules, such as hexan in contrast to erythromycin, as its substrates [45]. Therefore, overproduction of the tripartite system can render a Gram-negative pathogen resistant against multiple antibiotics at once. The mechanisms of how AcrB is able to recognize such an enormous spectrum of molecules as substrates, without compromising its specificity (e.g. by neglecting essential compounds like lipids or gluclose as its susbtates), remained puzzling. Structural insight into substrate specificity was so far limited to two co-crystal structures of AcrB, where minocycline and doxorubicin, respectively, were identified bound to an internal binding pocket of AcrB. This binding pocket is particularly deeply buried into internal parts of the T monomer of AcrB and was, therefore, denoted deep binding pocket (DBP). Analysis of several AcrB co-crystal structures with substrate molecules bound to the DBP [4, 23, 25] indicated that the substrate promiscuity involved multisite binding modes within the DBP. Multisite binding modes, where different substrate molecules can bind to slightly different positions and orientations to the same binding pocket, is a common feature of multidrug recognizing proteins such as QacR or BmrR [27-29]. Nevertheless, AcrB's substrate spectrum is much broader than substrate spectra of most other multidrug recognizing proteins. Therefore, it is likely that additional mechanisms are involved in mediating the observed high substrate promiscuity of AcrB. In our recently published high-resolution AcrB/doxorubicin co-crystal structure (pdb entry: 4DX7 [23]) we were able to identify two additional substrate binding pockets in the L monomer of AcrB: i) the access pocket (AP), with an opening towards the periplasm, and ii) a putative binding site in a groove between transmembrane helices 8 and 9 (TM8/TM9 groove), accessible from the lipid layer of the inner membrane. Both binding pockets are likely to be access sites for substrates towards AcrB. Furthermore, each of the binding pockets are possibly specialized to recognize a specific subset of the entire substrate spectrum of AcrB, i.e. highly hydrophobic substrates (e.g. n-dodecyl-ß-d-maltoside or sodium dodecylsulfate) might access AcrB towards the TM8/TM9 groove and water soluble substrates (e.g. berberine) might access AcrB towards the AP. Since substrates will accumulate in the membrane or the periplasm according to their hydrophilic or hydrophobic nature, substrates will be "pre-selected" by the medium, rather than by the protein itself, and guided to their appropriate access site. This process is proposed to be called "medium- mediated pre-selection". The AcrB/doxorubicin co-crystal structure (pdb entry: 4DX7 [23]) furthermore revealed that the AP and DBP are in next neighborhood to each other and are separated by a switch loop. This switch loop adopts distinct conformations in the L, T and O monomers. Specific switch loop conformations are strongly involved in coordinating the selective occupation of both binding pockets, the AP and the DBP. The conformation of the switch loop in the L monomer (L-switch loop) opens the AP and closes the DBP, whereas the conformation of the switch loop in the T monomer (T-switch Loop) opens the DBP and closes the AP. An analysis of all asymmetric AcrB structures indicated that the L-switch loop is able to adopt multiple distinct conformations, whereas the conformation of T-switch loop remained largely congruent in all crystal structures. Moreover, each distinct switch loop conformation, observed in co-crystal structures of AcrB with occupied AP [4, 23], was perfectly adapted to the bound substrate molecule. Therefore, the putatively flexible switch loop is likely to act as an adaptive module and mediates a high binding pocket plasticity without altering the global protein structure. This binding mode is called adaptor-mediated binding mechanism, where an flexible adaptive module (like the switch loop) is able to adapt the surface shape of an binding pocket to different substrate molecules. Furthermore, structural and biochemical analyses of an AcrB G616N variant, revealed the involvement of specific switch loop conformations in the substrate specificity of AcrB. A substitution of G616, located on the switch loop, to N616 was able to alter the conformation of the switch loop exclusively in the L monomers of AcrB, whereas the switch loop conformations in T and O monomers remained congruent to the conformations observed in crystal structures of wildtype AcrB. Moreover, cells producing the AcrB G616N and MexB, both bearing the G616N amino acid substitution, exhibited a reduced resistance against certain substrates, whereas the resistance against most other substrates remained on the level of wildtype AcrB. Correlations of the phenotypes with minimal projection areas, a novel 2-spatiodimensional parameter which approximates the size of a substrate molecule, revealed that AcrB variants with a G616N substitution have a reduced efflux activity for exclusively large substrate molecules. The rejection of large substrates is most likely connected with altered L-switch loop conformations....
  • Gram-negative Bakterien wie Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii und Pseudomonas aeruginosa entwickeln heutzutage immer häufiger Multiresistenzen aus. Da Gram-negative Bakterien auch häufig opportunistische Infektionen in meistens schon immungeschwächten Patienten hervorrufen können, kann ihre Multitresistenz zu komplizierten Krankheitsverläufen führen. Ein zentraler Mechanismus für die Ausbildung von Multiresistenzen ist der Export von Antibiotika durch tripartite Pumpen. Die wichtigste tripartite Pumpe in E. coli besteht aus drei Proteinkomponenten: AcrA, AcrB und TolC. Von diesen drei Proteinkomponenten ist insbesondere AcrB von zentraler Bedeutung, da es sowohl für die Substraterkennung als auch die Energetisierung des gesamten tripartiten Systems verantwortlich ist. In der asymmetrischen Röntgenkristallstruktur von AcrB liegen alle drei Monomere des AcrB-Homotrimers in verschiedenen Konformationen vor [24, 25]. Diese werden Loose (L), Tight (T) und Open (O) genannt und repräsentieren die sukzessiven Zustände des Transportmechanismus. Eine Besonderheit von AcrB ist dessen außergewöhnlich großes Substratspektrum. Es können strukturell sehr unterschiedliche Moleküle wie zum Beispiel große Erythromycinmoleküle im Gegensatz zu kleinen Hexanmolekülen als Substrat erkannt werden. Durch das außergewöhnlich große Substratspektrum ist die Expression des AcrA-AcrB-TolC-Systems ein wichtiger Faktor für die Ausbildung von Multiresistenzen. Die Mechanismen, die AcrB zu diesem breiten Substratspektrum befähigen, blieben weitesgehend unbekannt. Das Wissen über spezifische Substratbindung war bisher auf zwei AcrB/Substrat-Cokristallstrukturen begrenzt, in denen entweder Doxorubicin oder Minocyclin in einer internen Bindetasche gebunden vorlagen. Diese Bindetasche befindet sich weit im Proteininneren vom T-Monomer von AcrB und wurde daher Deep binding pocket (DBP) genannt. Die Analyse von AcrB Strukturen mit substratbesetzten DBPs (pdb code: 2DRD, 2DR6 [25], pdb code: 4DX5, 4DX7 [23]) hat gezeigt, dass die Subtratmoleküle an unterschiedlichen Stellen und in verschiedenen Orientierungen an die DBP binden können. Dieser Bindungsmechanismus, in denen Substrate multiple Bindungsmodi an einer einzigen Bindetasche aufweisen, wird als multisite binding modes bezeichnet und wurde bereits im Detail an Multiresistenz-regulierenden Proteinen wie, z.B. BmrR und QacR, strukturell beschrieben [27-29]. Das Substratspektrum von AcrB ist aber weitaus größer als bei den meisten anderen multisubstrat-spezifischen Proteinen. Desweiteren stellt sich die Frage, wie AcrB in der Lage ist, ein so großes Spektrum an unterschiedlichsten Molekülen als Substrate zu erkenennen, ohne Kompromisse in seiner Spezifität einzugehen. Zum Beispiel genügt der Austausch der 6-(2-Amino)-Gruppe des AcrB-Substrats Ampicillin durch eine Carboxygruppe an derselben Stelle in Carbenicillin aus, um nicht mehr von AcrB als Substrat erkannt zu werden. Daher lag es nahe, dass AcrB weitere Mechanismen zur Diskriminierung von Substraten und Nicht-Substraten besitzen muss. Weitere Erkenntnisse konnten durch unsere kürzlich veröffentlichte hochaufgelöste AcrB/Doxorubicin Cokristallstruktur (pdb code: 4DX7 [23]) gewonnen werden. In dieser Struktur konnten, zusätzlich zu der bereits bekannten DBP im T-Monomer, zwei weitere Subtratbindetaschen im L-Monomer von AcrB identifiziert werden: 1.) die Eintritts- Bindetasche (engl.: access pocket (AP)) zwischen den periplasmatischen Subdomänen PC1 und PC2 sowie 2.) eine tiefe Furche zwischen den Transmembranhelices 8 und 9 (TM8/TM9 groove). Beide neu identifizierten Bindetaschen stellen höchstwahrscheinlich alternative Eintrittsstellen für Substrate in das Innere von AcrB dar. Die Existenz von verschiedenen alternativen Eintrittsstellen von Substraten könnten zu dem großen Substratspektrum von AcrB beitragen. Die Substrate von AcrB können sich signifikant in ihren physiko-chemischen Eigenschaften, wie zum Beispiel ihrer Löslichkeit in Wasser oder Öl (bzw. Lipide, Octanol), unterscheiden. Stark hydrophobe Moleküle werden daher größtenteils in der Membran akkumuliert vorliegen, wohingegen gut wasserlösliche Moleküle sich größtenteils im Periplasma oder Zytoplasma aufhalten werden. Die sich im Zytoplasma befindenden Moleküle werden wahrscheinlich durch andere Membrantransporter in das Periplasma transportiert [1]. Die alternativen Eintrittsstellen, AP und TM8/TM9 groove, könnten spezialisiert auf bestimmte Substratmoleküle sein, d.h. wasserlösliche Substrate gelangen vom Periplasma durch die AP in das Innere von AcrB, wohingegen Lipid-ähnliche Substrate (wie Detergentien) von der Membran durch die TM8/TM9 groove in AcrB aufgenommen werden. Daher findet anhand der physiko-chemischen Eigenschaften der Substrate eine Vorselektion von Molekülen durch das Medium statt. Diese Vorselktionen außerhalb des Proteins führt die verschiedenen Substratmoleküle zu den spezialisierten AcrB- Eintrittsstellen....

Download full text files

  • Thesis_Cha_2013.pdf
    eng

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author:Hi-jea Cha
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-335610
Referee:Klaas Martinus PosORCiD, Bernd LudwigGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2014/05/06
Year of first Publication:2013
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2013/11/22
Release Date:2014/05/06
Page Number:197
First Page:1
Last Page:197
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:364932163
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License LogoArchivex. zur Lesesaalplatznutzung § 52b UrhG