Open Access

René Verboket

• Bei Knochendefekten kritischer Größe ist es notwendig, den Knochen bei der Heilung zu unterstützen. Der derzeitige Goldstandard bei der Behandlung von critical size defects ist die Entnahme von autologem Knochen aus dem Beckenkamm, dies ist jedoch mit Nachteilen wie Entnahmemorbidität und Limitierung der entnehmbaren Menge vergesellschaftet. Das Knochen tissue engineering, bei welchem regenerative Zellen mit einem Knochenersatzmaterial kombiniert werden, könnte eine vielversprechende Alternative sein. Stromale Knochenmarkzellen, die Osteoblasten differenzieren können, und endotheliale Vorläuferzellen, die die Vaskularisierung der Defektzone unterstützen, zeigten sich effektiv in tierexperimentellen Studien; jedoch müssen diese Zellen vor Verwendung über einen längeren Zeitraum in Kultur expandiert werden. Dies kann jedoch zu einer Akkumulation genetischer Schäden und möglicherweise zu einer Entartung der transplantierten Zellen führen. Bone marrow mononuclear cells (BMC) stellen eine interessante Alternative dar, sie können innerhalb weniger Stunden isoliert und dem Patienten zurückgegeben werden. Ziel dieser Arbeit war daher, die Adhäsion und funktionelle Aspekte von BMC auf drei verschiedenen Knochenersatzmaterialien zu analysieren. Im ersten Versuchsteil wurde untersucht, ob es möglich ist, BMC auf einem β-Tricalciumphosphat (β-TCP)-Scaffold auszusäen, und ob eine Beschichtung des Scaffolds eine positive Auswirkung auf die BMC-Adhäsion und Aktivität hat. Hierbei wurde eine Beschichtung mit humanem Plasma (FFP) und Fibronektin gegen eine Kontrolle verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass BMC auf unbeschichtetem β-TCP adhärieren und dass eine Vorbeschichtung des Scaffolds mit Fibronektin oder mit FFP zu keiner weiteren Verbesserung der initialen Adhäsion führt. FACS-Analysen zeigten, dass der Prozentsatz der auf dem Material adhärierenden Fraktionen regenerativer Zellen dem Prozentsatz der in der Kontrolle enthaltenen regenerativen Zellen entspricht. Überdies konnte eine endotheliale Differenzierung der ausgesäten BMC beobachtet werden. Die Anzahl adhärierender BMC war zum ersten Messpunkt an Tag zwei unabhängig von der Vorbeschichtung am höchsten. Interessanterweise war die Zahl der adhärierenden BMC auf unbeschichtetem Material signifikant gegenüber den beschichteten Materialien erhöht. Basierend auf der Beobachtung, dass eine Vorbeschichtung der Trägersubstanz nicht zu einer Verbesserung der BMC-Adhäsion auf dem Gerüststoff führt, wurden im zweiten Versuchsteil unbeschichtete Gerüststoffe miteinander verglichen. Für diese Arbeit wurden drei aus verschiedenen Klassen der Knochenersatzmaterialien stammende Scaffolds gewählt. ChronOs® als Vertreter der β-TCPs, Cerabone®, eine verarbeitete bovine Knochenmatrix, und Demineralized Bone Matrix (DBM), ein sterilisiertes humanes Knochentransplantat. Die Untersuchungen ergaben signifikante Unterschiede in der Aussaateffizienz der Zellen auf den Materialien und der Zellaktivität im Verlauf über 21 Tage. DBM zeigte hier im Materialvergleich die besten Ergebnisse. In unserem Versuch zeigte sich die Menge der absorbierten Flüssigkeit im Verhältnis zur Materialmenge bei DBM signifikant erhöht gegenüber den beiden anderen Materialien. Zudem konnte mittels HE- und Kern-Färbung (DAPI) der Nachweis erbracht werden, dass sich Zellen tief im Inneren des Materials anlagern. MTT-Tests zeigten an Tag 14 eine signifikant erhöhte metabolische Aktivität auf DBM gegenüber Cerabone® und an Tag 21 gegenüber beiden Vergleichsmatrices. Wir konnten auf allen Materialien an Tag 2 eine signifikant erhöhte VEGF-Produktion feststellen. Mittels Real-Time-PCR ließ sich eine VEGF-Genexpression in BMC auf allen Materialien bis Tag 14 und auf DBM über die kompletten 21 Tage nachweisen. Die Genexpression von vWF konnte ebenfalls auf allen Materialien über den gesamten Zeitraum nachgewiesen werden. Zusammengefasst konnte durch diese Studie belegt werden, dass die initiale Adhärenz von BMC auf unbeschichtete Knochenersatzmaterialien generell hoch ist, aber signifikante materialspezifische Unterschiede in der Aussaateffizienz und nachfolgend der metabolischen Aktivität und der VEGFSynthese der BMC existieren. Humanes Knochenersatzmaterial zeigte sich in unserer Studie als überlegen. Daher sollte die Art des Knochenersatzmaterials für den künftigen klinischen Einsatz von BMC Berücksichtigung finden.
• Critical size bone defects require arrangements to support bone healing. Actual gold standard in critical size defect treatment is the harvest of autologous bone from the ischiadic spine. This is associated with the disadvantage of extraction morbidity and the limit of extractable amount. Bone tissue engineering using regenerative cells and a bone substitute material could be a promising alternative. Stromal bone marrow cells capable of differentiating into osteoblasts and endothelial progenitor cells which support vascularisation of the defect zone are shown promising in animal trials. These cells have to be expanded in cell culture over a longer period of time increasing the risk of genetic damage to accumulate and possibly leading to degeneration of the transplanted cells. Bone marrow mononuclear cells (BMC) represent an interesting solution. It is possible to isolate them within a couple of hours and give them back to the patient. Therefore the goal of this study was to evaluate adhesion and functional aspects of BMC on three different kinds of bone substitute material. The first part of the study analysed if it is possible to seed BMC on a β-tricalciumphosphat (β-TCP)-scaffold and if there is a positive effect of coating the scaffold in adhesion and activity. In this setting we compared human plasma (FFP) and fibronectin against a control group without coating. We were able to show adherence of BMC on uncoated β-TCP as well as non-improved adhesion on scaffolds coated with fibronectin or FFP. FACS-analysis demonstrated correlating percentages of regenerative cells adhering on the material and in a control group. Moreover we were able to observe an endothelial differentiation of the seeded BMC. The number of adhering BMC was highest on day two irrespective of a coating. Interestingly the number of adhering BMC on uncoated material was significantly superior to the number on coated material. Based on the observation that a pre-coating of the bone substitute material does not lead to an improved BMC adhesion, we compared in the second part of the study uncoated bone substitute materials. We chose for this study scaffolds from three different classes of bone substitute materials. ChronOs® representing the β-TCPs, Cerabone®, a processed bovine bone matrix, and Demineralized Bone Matrix (DBM), a sterilised human bone transplant. The analyses demonstrated significant differences in seeding efficiency and cell activity over the period of 21 days. DBM was able to outrange the other matrices. In our study we were able to show that the liquid absorbance to amount ratio significantly was higher on DBM compared to the other matrices. Furthermore using HE- and nucleus-staining (DAPI) we could provide evidence of BMC accumulating deep inside the material. MTT-tests on day 14 demonstrated a significantly increased metabolic activity on DBM compared to Cerabone® and on day 21 compared to both other matrices. We were able to show a significantly increased VEGF production on day 2 on all matrices. Via real time PCR we were able to show a VEGF-gene expression on all materials until day 14 and on DBM until day 21. Likewise we were able to show a vWF-gene expression on all materials until day 21. Summarised, we were able to show an initially high adherence of BMC on uncoated bone substitute material albeit differences between the biomaterials exist. Besides differences in the seeding efficiency, metabolic activity and VEGF synthesis were observed. Human bone substitute material appeared to be superior in our study. Hence, the kind of biomaterial should be considered for future clinical use of BMC.