Open Access

Behnaz Abhari

• Inhibitor of Apoptosis (IAP) proteins are expressed at high levels in many cancers and contribute to apoptosis resistance. Therefore, they represent promising anticancer drug targets. Here, we report that small molecule IAP inhibitors at subtoxic concentrations cooperate with monoclonal antibodies against TRAIL receptor 1 (Mapatumumab) or TRAIL receptor 2 (Lexatumumab) to induce apoptosis in neuroblastoma cells in a highly synergistic manner (combination index <0.1). Importantly, we identify RIP1 as a critical regulator of this synergism. RIP1 is required for the formation of a RIP1/FADD/caspase-8 complex that drives caspase-8 activation, cleavage of Bid into tBid, mitochondrial outer membrane permeabilization, full activation of caspase-3 and caspase-dependent apoptosis. Indeed, knockdown of RIP1 abolishes formation of the RIP1/FADD/caspase-8 complex, subsequent caspase activation and apoptosis upon treatment with IAP inhibitor and TRAIL receptor antibodies. Similarly, inhibition of RIP1 kinase activity by Necrostatin-1 inhibits IAP inhibitor- and TRAIL receptor-triggered apoptosis. By comparison, over-expression of the dominant-negative superrepressor IκBα-SR or addition of the TNFα-blocking antibody Enbrel does not inhibit IAP inhibitor- and Lexatumumab-induced apoptosis, pointing to a NF-κB- and TNFα-independent mechanism. Of note, IAP inhibitor also significantly reduces TRAIL receptor-mediated loss of cell viability of primary cultured neuroblastoma cells, underscoring the clinical relevance. By demonstrating that RIP1 plays a key role in the IAP inhibitor-mediated sensitization for Mapatumumab- or Lexatumumab-induced apoptosis, our findings provide strong rationale to develop the combination of IAP inhibitors and TRAIL receptor agonists as a new therapeutic strategy for the treatment of human cancer.
• Apoptose bezeichnet das intrinsische Suizidprogramm der Zelle und kann durch mindestens zwei unterschiedliche Signalwege induziert werden. Der extrinsische (Todesrezeptor-vermittelte) Signalweg wird durch die Bindung eines Tumornekrosefaktor (TNF)-Liganden, wie beispielsweise TRAIL, an den entsprechenden Zelloberflächenrezeptor, zum Beispiel den TRAIL Rezeptor, aktiviert. Dies induziert die Bildung des Zelltod-induzierenden Signalkomplexes (DISC), welcher zur Aktivierung von Caspase-8 führt. Der intrinsische (mitochondriale) Signalweg bewirkt die Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran, welche zur Freisetzung von Cytochrom C und SMAC (second mitochondria-derived activator of caspases) in das Cytosol führt. Cytochrom C leitet die Bildung des Caspase-9 Aktivierungskomplexes, dem sog. Apoptosom, ein, während SMAC die durch IAP (inhibitor of apoptosis) Proteine bewirkte Hemmung der Caspasen aufhebt. In menschlichen Krebserkrankungen ist dieser Mechanismus der Zelltodinduktion oft dereguliert. Resistenz von Krebszellen gegenüber Apoptoseinduktion kann durch eine abnorme Expression von anti-apoptotischen Proteinen verursacht werden. So konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass IAP Proteine in vielen Krebsarten überexprimiert sind und zur Resistenz gegenüber Apoptose führen. Um die Funktion der IAP Proteine zu neutralisieren, wurden SMAC Mimetika oder niedermolekulare IAP Antagonisten entwickelt, welche mit der durch XIAP verursachten Caspasehemmung interferieren. Zusätzlich verursachen SMAC Mimetika einen proteasomalen Abbau der IAP Proteine, welche eine RING-Domäne mit E3-Ligase Aktivität besitzen, beispielsweise cIAP-1 (cellular inhibitor of apoptosis proteins). Der Verlust der cIAPs führt zur Deubiquitinylierung von RIP-1 (receptor activating protein 1) und Formation des RIP1/FADD/Caspase-8-Komplexes, der zur Aktivierung von Caspase-8 führt [187, 281]. Des Weiteren führt der Abbau von cIAPs zu einer Aktivierung des nichtkanonischen NF-κB Signalweges, welcher zur Induktion von TNFα, einem klassischen NF-κB Zielgen, führt. TNFα wurde als ein wichtiger Vermittler der SMAC Mimetika-induzierten Apoptose durch einen auto- oder parakrinen Loop beschrieben. Das Neuroblastom gehört zu den am Häufigsten vorkommenden pädiatrischen, soliden Tumoren außerhalb des zentralen Nervensystems. Weil die Prognose für Kinder mit einem Neuroblastom im fortgeschrittenen Status immer noch schlecht ist, werden neue Behandlungsstrategien gesucht. Kürzlich wurde von uns in einer Studie das Konzept bewiesen, dass SMAC-Peptide in Neuroblastomzellen die TRAIL-induzierte Apoptose fördern. Zurzeit werden nicht-proteinbasierende, niedermolekulare IAP Inhibitoren, die XIAP, cIAP1 und cIAP2 antagonisieren, sowie agonistische TRAIL Rezeptor Antikörper für erste klinische Studien entwickelt. Jedoch zeigten sowohl der TRAIL R1 Antikörper Mapatumumab, als auch das SMAC Mimetikum LCL161 als Einzeltherapie nur eine geringe in vitro- und in vivo-Aktivität in zwei aktuellen Studien von pädiatrischen Testprogrammen. Dies zeigt, dass die Monotherapien für beide Substanzen nicht ausreichend sind, um das Tumorwachstum zu kontrollieren. Diese Ergebnisse heben hervor, dass eine rationale Kombinationsstrategie besonders bedeutend ist, um das therapeutische Potential dieser Substanzen optimal zu nutzen. Daher evaluierten wir in der vorliegenden Arbeit die Zelltod induzierende Wirkung von IAP Inhibitoren in Kombination mit agonistischen TRAIL-R1 und –R2 spezifischen Antikörpern. Zunächst untersuchten wir den Effekt humaner monoklonaler Antikörper, die spezifisch gegen TRAIL-R1 (Mapatumumab) und TRAIL-R2 (Lexatumumab) gerichtet sind, in Kombination mit einem niedermolekularen IAP Inhibitor auf verschiedene humane Neuroblastom Zelllinien. Von Bedeutung ist, dass die IAP Inhibitoren in Kombination mit Mapatumumab als auch mit Lexatumumab den Vitalitätsverlust verstärkten. Dosistitrationsversuche und die Berechnung des Kombinationsindex ergaben, dass die Wirkung von Mapatumumab sowohl mit IAP Inhibitor 1 also auch mit IAP Inhibitor 2 synergistisch waren. Im Gegensatz dazu verhielten sich Neuroblastom Zelllinien ohne oder mit niedrigem Expressionsniveau von Caspase-8 auch unter der Wirkung von IAP Inhibitoren resistent gegenüber TRAIL Rezeptor Antikörpern. Dieses Ergebnis bestätigt die wesentliche Rolle von Caspase-8 bei der TRAIL-induzierten Apoptose. Interessanterweise führt die Vorbehandlung von NB Zellen mit IFNγ zur Reexpression von Caspase-8 und damit zu deren Sensitivierung gegenüber Lexatumumab und IAP Inhibitor induziertem Vitalitätsverlust. Um die klinische Relevanz unseres Therapieansatzes zu beurteilen, haben wir unsere Versuche auf primäre Neuroblastom Kulturen ausgeweitet, welche aus chirurgischen IAP Inhibitor- und Lexatumumab- vermittelten Verlust der Zellvitalität, noch die Caspaseaktivierung oder die Spaltung von Bid. Vorbehandlung mit dem Antikörper Enbrel, welcher TNFα blockiert, konnte den IAP Inhibitor- und Lexatumumab-vermittelten Vitalitätsverlust ebenfalls nicht inhibieren. Zusammenfassend weisen diese Experimente darauf hin, dass NF-κB-Aktivierung und TNFα für die durch IAP Inhibitor- und Lexatumumab-vermittelte Apoptose unerheblich sind. Wie bereits gezeigt werden konnte verursacht der Abbau von cIAP Proteinen die Deubiquitinylierung von RIP1 und infolgedessen kommt es zusammen mit dem Adapterprotein FADD zur Ausbildung des Caspase-8-Komplexes. Daher untersuchten wir zunächst die Rolle von RIP1 in der IAP Inhibitor- und Lexatumumab-vermittelten Apoptose, wobei wir zeigen konnten, dass IAP Inhibitor und Lexatumumab zusammenwirken, um die Ausbildung eines Komplexes aus RIP1, Caspase-8 und FADD zu fördern. Um zu klären, ob RIP1 für die IAP Inhibitor- und Lexatumumab-induzierte Apoptose benötigt wird, verwendeten wir Necrostatin-1, einen selektiven allosterischen RIP1 Inhibitor. Necrostatin-1 war in der Lage, die durch den IAP Inhibitor verursachte Sensibilisierung gegenüber Lexatumumab-vermittelter Apoptose zu reduzieren. Zudem schwächte die Zugabe von Necrostatin-1 die Interaktion von RIP1 mit Caspase-8 und FADD nach Behandlung mit IAP Inhibitoren und Lexatumumab, was den Schluss zulässt, dass die RIP1 Kinaseaktivität für die Ausbildung des RIP1/FADD/Caspase-8 Komplexes benötigt wird. Ein RIP1 knockdown mittels RNAi führte ebenfalls zu einem Abbau des RIP1/FADD/Caspase-8 Komplexes, sowie Verlust der Caspaseaktivierung nach Kombinationsbehandlung. Zudem führte der Verlust von RIP1 zu einer signifikanten Reduktion der Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials sowie dem Verlust der Zellvitalität und der Apoptose. Im Einklang mit unseren Daten, welche zeigen, dass der IAP Inhibitor die Bildung des TRAIL-DISC-Komplexes nicht ändert, zeigte der RIP1 knockdown ebenfalls nur einen geringen Effekt auf die Bildung des TRAIL-DISC-Komplexes nach Behandlung mit Lexatumumab und/oder dem IAP Inhibitor. Diese Daten bestätigen, dass RIP1 ein kritischer Faktor der synergistischen Induktion von Apoptose durch IAP Inhibitoren und TRAIL Rezeptor-Agonisten in Neuroblastomzellen ist. Die Relevanz dieser Studie liegt insbesondere in dem Ergebnis, dass IAP Inhibitoren Neuroblastomzellen für TRAIL-R1- und TRAIL-R2-induzierte Apoptose sensitivieren welche RIP1-abhängig ist, aber unabhängig von NF-κB und TNFα verläuft. Diese Ergebnisse sind aus mehreren Gründen bedeutsam. Erstens bildet diese Studie die Grundlage für die weitere Entwicklung von IAP Inhibitoren und TRAIL Rezeptor Antagonisten für die Behandlung des Neuroblastoms in klinischen Studien. Weiterhin zeigt diese Studie, dass die Kombinationsbehandlung mit IAP Inhibitoren und TRAIL Rezeptor Antagonisten auch in Neuroblastomzellen mit epigenetischer Inaktivierung von Caspase 8 geeignet ist, welche in 75 % aller Neuroblastoma vorliegt. IAP Inhibitoren sowie TRAIL Rezeptor Agonisten befinden sich derzeit in frühen klinischen Studien. Dies zeigt, dass die Kombinationsbehandlung beider Substanzen realisierbar ist. Die vorliegende Studie gibt außerdem neue Einblicke in die niedermolekularen Mechanismen von Signaltransduktion in Krebszellen, welche durch die synergistische Kombinationsbehandlung aus IAP Inhibitoren und TRAIL reguliert werden. Neben einer potentiellen Behandlungsmethode für das Neuroblastom zeigt diese Studie somit einen generellen Ansatzpunkt für eine IAP Inhibitor-basierte Kombinationsbehandlung auch anderer Krebsarten und ist damit von weitreichender Bedeutung.