Open Access

Andreas Volk

• So far clinical human immunodeficiency virus (HIV) therapy is limited to non-curative treatments. However, as recently shown, alternative approaches such as HIV gene therapy have the potential to functionally cure the disease (e.g. the hematopoietic stem cell (HSC)-transplantation with a CCR5Δ32 homozygous transplant) (1). In contrast to the highly personalized medical treatment applied in the ‘Berlin case’, more broadly applicable approaches are currently under intensive investigation. One example is the adeno-associated-virus (AAV)-mediated delivery of in vivo secreted antiviral entry inhibitors (iSAVE), the concept of which is based on the direct in vivo administration of a broadly applicable highly potent antiviral gene (here: a C46-derived entry inhibitory peptide interfering with HIV-1 membrane fusion). The AAV-based gene delivery is believed to overcome several limitations of gene therapeutic treatments based on ex vivo lentiviral trials in the past. It is (i) targeting differentiated HIV target cells (i.e. liver and differentiated lymphatic cells) reducing the risk of genotoxicity compared to stem cell-based trials, (ii) overcoming the limitation of a low number of genetically modifiable cells as in lentivirally based ex vivo transduction strategies (i.e. limited modifiable cell number due to culture conditions and lower vector titers) and (iii) using the safe AAV vector system, which has not been associated with major genotoxicity in men. (iv) Most importantly, the concept of secretable entry inhibitors does not require transduction of large amounts of cells due to the protective bystander effect. Thus, iSAVE might be a treatment principle for HIV infection that might be able to cure patients irrespective of their viral isolates or adherence. Accordingly, the iSAVE concept could aim at two different sites in the patient for the production of antiviral transgenes, either the systemic production via suitable producer cells (e.g. hepatocytes) or the local production in the lymphatic system. In a first approach, we are able to efficiently target hepatocytes using the natural AAV serotype 8 to express high plasma levels of secretable antiviral entry inhibitors in order to systemically suppress viral replication. In this setting we could show that iSAVE peptides are highly expressed in hepatocytes. However, plasma levels of iSAVE were insufficient when using a secretable peptide as sole antiviral transgene. As a second treatment strategy, the iSAVE project aimed to deliver antiviral genes directly to the site of viral replication, the lymphatic system. Here, (i) a panel of naturally occurring AAV serotypes as well as (ii) AAV retargeting approaches were employed to design a highly efficient and selective AAV vector variant for gene delivery into the lymphatic system after intravenous vector administration. In detail, (i) screening of the natural occurring serotypes revealed that the AAV serotype 1 (AAV-1) was best in targeting splenic tissue in two humanized mouse models, however at a very low level. After systemic AAV-1 vector administration neither transduction of human lymphocytes did occur nor was iSAVE expressed in the lymphatic system in a humanized mouse model. (ii) In a second approach, we modified the well-characterized AAV-2 serotype in a tropism-defining region of its capsid gene by insertion of human peripheral blood lymphocytes (hPBL)-tropic peptide ligands. These in turn were selected by M13 in vivo phage display and by in vivo AAV peptide display. Selected variants were cloned and tested for hPBL transduction in vitro. Although the selected variants did not show increased expression efficacies compared to AAV-2 WT, it still might be possible that the selected variant are more specific for hPBLs as these conditions have not been tested. As these selection processes required a humanized mouse model that comprises a functional lymphatic system, we established the previously described Trimera mouse model in our lab (2). We found that this mouse model could be further improved to allow engraftment of a lower number of gene-modified (gm) human T cells as in the classical Trimera model. These modified Trimera mice (mT3 mice) were conditioned by inclusion of cyclophosphamide (CTX) to the irradiation-conditioning scheme of the classical Trimera model. Comparison of mT3 mice with established NSG and DKO mice in an adoptive gm T cell transplantation setting revealed that NSG mice were the most robust model providing high reproducibility in human T cell engraftment. MT3 mice allowed a substantial, yet more variable engraftment of gm T cells. Besides comparing engraftment kinetics, the graft quality (i.e. clonality and cytokine milieu) was analyzed. Again, NSG mice showed the most balanced homeostatic repopulation three weeks after transplantation, while mT3 mice were prone to Th1-type, oligloclonal repopulation, indicating an early onset of xenograft-versus-host disease. Finally, the lymphatic infiltration was analyzed. As expected, mT3 mice provided the most intact lymphatic structures, although the normal lymphatic morphology was not restored. In conclusion, it was demonstrated in this work that AAV-mediated iSAVE gene therapy faces specific limitations depending on the respective targeting approach In the systemic approach, iSAVE peptides have to be further optimized in terms of transgene design itself, as high-level accumulation in murine plasma was not feasible for the short iSAVE precursor. In the local, lymphatic targeting approach, AAV-mediated expression faces its limits in targeting specificity but foremost expression efficacy. Thus, the AAV vector itself needs further optimization for sufficient local iSAVE expression levels. Independently from the AAV-related approaches, a novel humanized mouse model was established in this work. Despite drawbacks regarding repopulation variability and set-up complexity, the novel mT3 mouse model comprised improved secondary lymphatic structures for adoptive T cell transfer, which might be an interesting platform for studies in lymphoma or leukemia therapy.
• Die Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) ist trotz einer Vielzahl neuer Wirkstoffe im Rahmen der Kombinationstherapie (Hoch-aktive antiretrovirale Therapie; HAART) eine bislang unheilbare Erkrankung. Ferner weist die HAART zum Teil starke Nebenwirkungen auf, fordert aber gleichzeitig eine hohe Bereitschaft der Patienten, das Behandlungsregimen einzuhalten (Adhärenz). Dieser Fakt ist umso schwieriger für den Patienten, da ein Absetzen der Medikamente mit einer vorläufigen Verbesserung des allgemeinen Befindens einhergeht. Neuartige Behandlungsansätze hingegen haben das Potential, die HIV Infektion zu heilen ohne auf strikte Adhärenz angewiesen zu sein. Das gentherapeutische Konzept des in vivo sezernierbaren, antiviralen Eintrittsinhibitors (iSAVE) basiert auf der direkten, intravenäsen Applikation eines adeno-assoziierten viralen Vektors, der für das sekretierte C-Peptid C46 kodiert. Dieses Peptid blockiert den Viruseintritt nach Rezeptorbindung mit nanomolarer Affinität. Um eine effektive virale Suppression zu erreichen, muss eine ausreichende C-Peptid Konzentration an den Orten der viralen Replikation vorliegen. Hierzu sind zwei Varianten denkbar: eine systemische Produktion des Peptids über die Leber oder eine lokale Produktion des Peptids im lymphatischen Gewebe. Beide Ansätze wurden im Rahmen dieser Arbeit auf Durchführbarkeit und Effizienz untersucht. Im ersten Ansatz wurde die Leber mittels des hepatotropen AAV 8 Serotyps transduziert. Die Leber als Syntheseorgan einer Vielzahl von Plasmaproteinen scheint prinzipiell geeignet eine hohe Plasmakonzentration des C-Peptids zu erreichen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das iSAVE Peptid in Leberzellen nach systemischer Vektorgabe exprimiert wurde. Trotz des viralen Ursprungs des iSAVE Peptids wurde keine adaptive Immunantwort gegen das Peptid nachgewiesen. Allerdings war zu keinem Zeitpunkt iSAVE in Plasmaproben AAV-behandelter Tiere detektierbar. Im Gegensatz zu iSAVE, akkumulierten größere Referenzprodukte, die über das gleichen Vektorrückgrat exprimiert wurden (murines Erythropoietin sowie ein single chain Antikörperfragment), zu messbaren bzw. sehr hohen Plasmakonzentrationen. In einem zweiten Ansatz wurde versucht iSAVE am Ort der viralen Replikation des HI Virus zu exprimieren, dem lymphatischen Gewebe. Da bisher noch kein AAV Serotyp beschrieben wurde, der spezifisch das lymphatische Gewebe transduziert, wurden hierfür zwei Ansätze verfolgt. Zunächst wurde eine Reihe von natürlich vorkommenden AAV Serotypen bezüglich ihrer Transduktionseffizienz auf lymphatischem Gewebe und peripheren Blutlymphozyten (PBL) getestet. Der AAV-1 Serotyp war der einzige, der wiederholt in verschiedenen in vitro und in vivo Experimenten zu einer messbaren Transduktion und Expression in PBLs und dem lymphatischen Gewebe führte. In einem ersten Pilotexperiment konnte gezeigt werden, dass die in vitro Transduktion von PM-1 T Zellen mit dem AAV-1 Vektor zu einem selektiven †berleben genmodifizierter Zellen führen kann. Allerdings waren nach systemischer Applikation eines AAV-1 iSAVE kodierenden Vektors im Mausmodell die lymphatischen Transduktionslevel auf einem geringen Niveau und die iSAVE Proteinkonzentrationen nicht messbar. Da kein natürlich vorkommender AAV Serotyp für eine effiziente lymphatische Transduktion gefunden werden konnte, wurde in einem zweiten Ansatz versucht, den gut beschriebenen AAV-2 Serotyp mittels cell surface targeting für die Transduktion lymphatischer Zellen zu modifizieren. Hierzu wurden wiederum zwei unabhängige Ansätze verfolgt, die beide auf einer Selektion von geeigneten Peptidinsertionen aus Bibliotheken basierten. In ersten Ansatz wurde eine kommerzielle M13 pIII-7mer Phagenbibliothek auf peripheren Blutlymphozyten in vitro und in humanisierten NSG Mäusen in vivo selektioniert. In vitro Transduktionsstudien zeigten, dass nur eine Variante (D6) der fünf Klone auf Wildtypniveau exprimierte. Gleichzeitig wies dieser Klon eine reduzierte Selektivität gegenüber PBLs auf. Daher qualifizierte sich keine der gefundenen Varianten für weitere in vivo Experimente. Im zweiten Ansatz wurde eine AAV-2 Bibliothek herangezogen, die bereits zufällige 7-mer Peptidinsertionen an der AAV-Cap Position 587 trägt. Es wurden drei verschiedene Klone angereichert und in in vitro Experimenten getestet. Während Selektivitätsdaten noch ausstehen, zeigten die drei selektierten Vektorvarianten ähnlich-niedrige PBL-Transduktionsraten und Expressionslevel wie der AAV-2 WT. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit die Möglichkeit einer direkten in vivo Applikation eines AAV Vektors zur HIV Gentherapie über zwei verschiedene Ansätze evaluiert. Dabei wurde deutlich, dass eine systemische Verteilung des kleinen C46 Peptids nach Expression in der Leber auf Grund zu kurzer Plasmahalbwertszeiten nicht praktikabel ist. Im zweiten Ansatz, der lokalen, lymphatischen Expression, wurde gezeigt, dass zur Zeit kein AAV Serotyp bzw. keine geeignete Kapsidvariante zur Verfügung steht, die einen spezifischen Gentransfer mit hoher Expressionseffizienz im lymphatischen Gewebe ermöglicht. Beide Ansätze haben spezielle Herausforderungen, die weiterer Optimierung bedürfen. Im Sinne des leberspezifischen, systemischen Ansatzes sind Optimierungen in Bezug auf das Transgen selbst am dringlichsten, obgleich weitere Vektoroptimierungen hilfreich sein könnten. Die Ansätze zur lymphatischen Expression scheinen dem grundlegende Problem zu unterliegen, dass AAV Vektoren prinzipiell einem Expressionsblock in T Zellen zu entgegen laufen. Daher ist in diesem Gentransferansatz der erste Schritt, diese intrazellulären Blockaden zu identifizieren und in einem weiteren Schritt zu umgehen.