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Georgi Tushev

• Local protein synthesis has re-defined our ideas on the basic cellular mechanisms that underlie synaptic plasticity and memory formation. The population of messenger RNAs that are localised to dendrites, however, remains sparsely identified. Furthermore, neuronal morphological complexity and spatial compartmentalisation require efficient mechanisms for messenger RNA localisation and control over translational efficiency or transcript stability. 3’ untranslated regions, downstream from stop codons, are recognised for providing binding platforms for many regulatory units, thus encoding the processing of the above processes. The hippocampus, a part of the brain involved in the formation, organisation and storage of memories, provides a natural platform to investigate patterns of RNA localisation. The hippocampus comprises tissue layers, which naturally separate the principle neuronal cell bodies from their processes (axons and dendrites). Identifying the full-complement of localised transcripts and associated 3’UTR isoforms is of great importance to understand both basic neuronal functions and principles of synaptic plasticity. These findings can be used to study the properties of neuronal networks as well as to understand how these networks malfunction in neuronal diseases. Here, deep sequencing is used to identify the mRNAs resident in the synaptic neuropil in the hippocampus. Analysis of a neuropil data set yields a list of 8,379 transcripts of which 2,550 are localised in dendrites and/or axons. Using a fluorescent barcode strategy to label individual mRNAs shows that the relative abundance of different mRNAs in the neuropil varies over 5 orders of magnitude. High-resolution in situ hybridisation validated the presence of mRNAs in both cultured neurons and hippocampal slices. Among the many mRNAs identified, a large fraction of known synaptic proteins including signaling molecules, scaffolds and receptors is discovered. These results reveal a previously unappreciated enormous potential for the local protein synthesis machinery to supply, maintain and modify the dendritic and synaptic proteome. Using advances in library preparation for next generation sequencing experiments, the diversity of 3’UTR isoforms present in localised transcripts from the rat hippocampus is examined. The obtained results indicate that there is an increase in 3’UTR heterogeneity and 3’UTR length in neuronal tissue. The evolutionary importance of the 3’UTR diversity and correlation with changes in species,tissue and cell complexity is investigated. The conducted analysis reveals the population of 3’UTR isoforms required for transcript localisation in overall neuronal transcriptome as well as the regulatory elements and binding sites specific for neuronal compartments. The configuration of poly(A) signals is correlated with gene function and can be further exploit to determine similar mechanisms for alternative polyadenylation. Usage of custom specified methods for next-generation sequencing as well as novel approaches for RNA quantification and visualisation necessitate the development and implementation of new downstream analytic methods. Library methods for data-mining transcripts annotation, expression and ontology relations is provided. Usage of a specialised search engine targeting key features of previous experiments is proposed. A processing pipeline for NanoString technology, defining experimental quality and exploiting methods for data normalisation is developed. High-resolution in situ images are analysed by custom application, showing a correlation between RNA quantity and spatial distribution. The vast variety of bioinformatic methods included in this work indicates the importance of downstream analysis to reach biological conclusions. Maintaining the integrability and modularity of our implementations is of great priority, as the dynamic nature of many experimental techniques requires constant improvement in computational analysis.
• Lokale Proteinsynthese und ihre Bedeutung in der synaptischen Plastizität und Erinnerungsbildung definieren einen neuen Blick auf grundlegende zelluläre Mechanismen. Der Bestand von Boten-RNAs (mRNAs), die auf Dendriten lokalisiert sind, bleibt jedoch wenig bekannt. Weiterhin erfordern neuronale morphologische Komplexität und räumliche Bereichsbildung effiziente Mechanismen für die mRNA-Lokalisierung und Kontrolle über die Translationseffizienz oder Transkriptsstabilität. 3’ untranslatierte Bereiche, stromabwärts (downstream) vom Stop-Codon, sind für die Bereitstellung bindender Plattformen für viele regulative Einheiten erkannt, wodurch die Verarbeitung der obigen Verfahren codiert wird. Der Hippocampus, ein Teil des Gehirns, bei dem Gedächtnisbildung/Erinnerungen, Organisation und Speicherung beteiligt sind, bietet eine natürliche Plattform um Musster von RNA-Lokalisierung zu untersuchen . Der Hippocampus besteht aus Gewebeschichten, die grundsätzliche neuronale Zellkörpern von Ihren Fortsätzen (Axonen und Dendriten) normalerweise trennen. Die Ermittlung der vollständigen Ergänzung von lokalisiertem Transkript und die damit verbundenen 3’ UTR-Isoformen ist von großer Bedeutung, um grundlegende neuronale Funktionen und Prinzipien der synaptischen Plastizität zu verstehen. Solche Forschungsergebnisse können sowohl bei der Untersuchung der neuronalen Eigenschaften der Netzwerkbildung als auch bei den Schlüsselkomponenten von neuronalen Krankheiten angewendet werden. Hier verwenden wir Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden (Deep Sequencing) um die mRNAs zu identifizieren, die in dem synaptischen Neuropil im Hippokampus angesiedelt sind. Die Analyse eines Neuropil Datensatzes ergab eine Liste von 8.379 Transkripten, von denen 2.550 in Dendriten und / oder Axonen lokalisiert sind. Mit Hilfe einer fluoreszierenden Strichcode-Strategie, um einzelne mRNAs zu bezeichnen, zeigen wir, dass ihre relative Häufigkeit in der Neuropil über fünf Größenordnungen variert. Hochauflösende in-situ Hybridisierung Bestätigt die Anwesenheit von mRNAs sowohl in gezüchteten Neuronen als auch in Schnitten des Hippocampus. Unter den vielen identifizierten mRNAs, beobachteten wir einen großen Teil der bekannten synaptischen Proteinen, einschließlich Signalmoleküle, Gerüste und Rezeptoren. Diese Ergebnisse zeigen ein bisher unbeachtet enormes Potenzial der lokalen Proteinsynthesemaschinerie, das dendritische und synaptische Proteom zu versorgen, pflegen und ändern. Basierend auf den Fortschritten der Experimenten in Vorbereitung der nächsten Generation Sequenzierung beobachten wir die Vielfalt der 3’ UTR-Isoformen, die in lokalisierten Transkripten von dem Ratten-Hippocampus vorhanden sind. Unsere Ergebnisse bestätigen eine Zunahme der Heterogenität und 3’UTR Länge in neuronalem Gewebe. Wir untersuchen die evolutionäre Bedeutung der 3’ UTR-Vielfalt und korrelieren diese mit Änderungen in der Arten, Gewebe- und Zell-Komplexität. Die durchgeführte Analyse offenbart sowohl den Bestand der 3’ UTR-Isoformen, der für die Transkript-Lokalisierung in dem gesamten neuronalen Transkriptom erforderlich ist, als auch die regulatorischen Elemente und Bindungsstellen, die für neuronale Abteile spezifisch sind. Die Konfiguration der Poly(A)-Signalen wird mit Genefunktion korreliert und kann weiterhin nach ähnlichen Mechanismen für alternative Polyadenylierung untersucht werden. Die Verwendung von speziell angefertigten Methoden für Next-Generation-Sequenzierung sowie das neuartige Vorgehen zur RNA-Quantifizierung und Visualisierung erfordern die Entwicklung und Umsetzung von neuen nachgeschalteten Analyseverfahren. Wir bieten Bibliotheksmethoden für Annotation, Expression und Ontologierelation von Data-Mining-Transkripten. Wir schlagen die Nutzung einer spezialisierten Suchmaschine vor, die auf die wichtigsten Features von früheren Experimenten abzielt. Durch die Definition experimenteller Qualität und Nutzung von Methoden für die Datennormalisierung entwickeln wir eine Verarbeitungspipeline für Nanostring-Technologie. Hochauflösende in-situ Bilder, die durch eine spezialisierte Anwendung analysiert werden, zeigen eine Korrelation zwischen RNA-Menge und der räumlichen Verteilung. Die große Vielfalt von Bioinformatikmethoden, die in dieser Arbeit enthalten sind, betonnt die Bedeutung der Downstream-Analyse um biologische Schlussvolgerungen zu erzielen. Die Aufrechterhaltung der Integrierbarkeit und Modularität unserer Implementierungen ist von gorßer Priorität, da die dynamische Natur der experimentellen Techniken eine ständige Verbesserung der Computeranalyse erfordert...