Open Access

Manja Burggraf

• The prevalence of food allergies has increased in the westernized countries during the past decades. Clinical manifestations of food allergies involve the skin (e.g. atopic dermatitis), the respiratory tract (e.g. rhinitis, and asthma), the ocular area (e.g. conjunctivitis), the gastrointestinal tract (e.g. food-protein-induced enterocolitis syndrome, food-induced proctocolitis, and eosinophilic gastroenteropathies), and the cardiovascular system (e.g. anaphylaxis). A curative treatment of these diseases has not been established yet. Oral immunotherapy (OIT) has gained attention as a potential therapy for food allergies. Continuous feeding of allergenic diet applied in the model described here mirrors to a certain extent an OIT treatment. It might be therefore useful to investigate efficacy and safety of OIT pre-clinically. Mouse models have been widely used to analyse novel treatment approaches. Unfortunately, most of them have focussed on IgE-mediated hyperreactivity. Only a limited number of mouse models presenting mixed IgE- and non-IgE-mediated gastrointestinal symptoms and inflammation upon allergen-challenge are available. To study the mechanisms underlying the induction of food-induced gastrointestinal inflammation and subsequent oral tolerance induction, a mouse model of food-induced gastrointestinal allergy was established. BALB/c mice were sensitised with Ovalbumin (OVA) plus ALUM and subsequently challenged by feeding a diet containing egg white (EW diet). During the first seven days on EW diet, OVA-sensitised mice (OVA/ALUM EW mice) developed gastrointestinal symptoms (e.g. weight loss, ruffed fur, soft stool and less mobility) and inflammation in the small intestines accompanied by a strong induction of OVA-specific IgE antibodies and mouse mast cell protease-1 (mMCP-1). Proliferation of CD4+ T cells from spleen of OVA/ALUM EW mice was reduced compared controls. The result indicated that feeding EW diet induced T cell tolerance systemically. In contrast, CD4+ T cells isolated from MLN of OVA/ALUM EW mice showed stronger proliferation upon OVA stimulation in vitro than mice OVA-sensitised but fed a conventional diet, indicating that tolerance was not induced by short-term EW diet. Histological analysis of the small intestinal tissue of OVA/ALUM EW mice revealed strong inflammation present in the duodenum, jejunum and ileum at this time point. Interestingly, the observed symptoms in OVA/ALUM EW mice resolved spontaneously after 7 days on EW diet, if the feeding was continued. In the next steps the CD4+ T cell-mediated immune response after 28 days continuous EW diet was assessed and revealed that tolerance was induced systemically as well as locally. This was shown by reduced proliferation and cytokine secretion of CD4+ T cells from MLN of OVA/ALUM EW mice after long-term EW diet. However, the inflammation in the jejunum was aggravated instead of resolved at this time point of allergenic diet. Our results suggest that application of OIT in food-allergic patients with gastrointestinal inflammation may need to be reconsidered, since continuous administration of allergenic food may aggravate inflammation in the local tissue. Interestingly, only the jejunum was affected by a worsened condition, whereas duodenum and ileum resolved inflammation. In accordance to the observed jejunal inflammation mMCP-1 levels in the sera were not changed. Allergen-specific IgE levels did not reach baseline level after long-term EW diet, although they were reduced compared to levels in mice after 7 days on EW diet. This result suggests that residual OVA-specific IgE antibodies would promote the jejunal inflammation by sustained activation of mast cells. Furthermore, our results suggest that IL-4 produced by activated Th2 cells could be an effector molecule to induce intestinal inflammation. The second part of this thesis was aimed at verifying the hypothesis that IgE-mediated mast cell activation is a major effector mechanism in induction of chronic inflammation induced by long-term EW diet. For that mice deficient for FcεRI, a high affinity IgE receptor, were used. These mice were sensitised with OVA and fed EW diet as described for WT mice. Although FcεRI-deficient mice showed an intact Th2 immunity with IgE production, weight loss in the receptor-deficient mice was moderately induced by EW diet compared to WT mice, suggesting that this clinical symptom during the acute phase of allergic response is associated with IgE-mediated mechanisms. Surprisingly, the deficient mice presented comparable intestinal inflammation on day seven of EW diet as WT mice did. However, if EW diet was continued, recovery of intestinal inflammation was observed in FcεRI-deficient mice in contrast to WT mice. These results suggest that the induction of intestinal inflammation is not IgE-dependent. Nevertheless, this does not rule out a potential role of mast cells in the inflammation, because of their IgE-independent activation pathways. It also suggests the involvement of T cell-mediated mechanisms during induction of jejunal inflammation. Interestingly, the aggravated inflammation seen after long-term EW diet in WT mice seems to be IgE-dependent, considering that it was not observed in FcεRI-deficient mice. The elevated number of mast cells in the intestine of WT mice further led to a hypothesis that their continuous activation might be responsible for the chronification of allergic inflammation observed after long-term EW diet. In the context of OIT it further implies that IgE might be a poor prognostic factor for recovery of intestinal inflammation during and after an OIT treatment. In the third part of this thesis regulatory mechanisms employed by the immune system were analysed. Initial results from CD4+ T cells isolated from MLN from OVA/ALUM EW mice showed elevated IL-10 levels in their supernatants after short-term EW diet. IL-10-deficient mice were used to analyse the effect of this immunosuppressive cytokine in the mouse model presented here. However, IL-10-deficient mice tend to develop a strong Th1-dominated immune response. Nevertheless, an accelerated weight loss and slight inflammation of the jejunum was observed after short-term EW diet. Analysis of OVA-specific proliferation and cytokine production CD4+ T cells from Spleen and MLN of IL-10-deficient mice on EW diet suggested that systemic as well as local tolerance was induced after short-term and long-term EW diet feeding, respectively. The result suggests that IL-10 is dispensable for induction of T cell tolerance in our mouse model. However, the presence of functionally active Tregs was observed during this study in WT mice fed short-term EW diet, suggesting that Tregs might have an important role in regulating the systemic or local immune response. T cell deletion as an alternative immune regulatory mechanism was also observed. Additionally, the efficacy of continuous EW diet (mirroring to a certain extent an OIT treatment) in induction of permanent tolerance was assessed. In OVA-sensitised WT mice continuous allergenic diet was stopped after resolution of clinical symptoms and reintroduced after a defined period on conventional diet. Evaluating the weight development showed that reintroduction of EW diet induced weight loss again, but not as pronounced as seen after short-term EW diet. Also the CD4+ T cell-mediated response was elevated again upon allergen stimulation in vitro. The results suggested that permanent tolerance was not induced in the chosen feeding regime. The mouse model established and analysed here was used to investigate inflammatory and regulatory mechanisms underlying food-induced gastrointestinal allergy. It presents clinical symptoms and intestinal inflammation (Burggraf et al., 2011). This model is easy to be reproduced in different laboratories, and is useful for testing novel therapy approaches (Schülke et al., 2011; Bohnen et al., 2013). It further provides an opportunity to investigate basic mechanisms underlying OIT. This therapy approach is currently extensively investigated and our mouse model would help to understand the therapeutic mechanism of OIT.
• Die Häufigkeit nahrungsmittelinduzierter Allergien nimmt in den industrialisierten Ländern kontinuierlich zu. Bis heute konnte keine kurative (heilende) Therapie entwickelt werden. Es gibt eine Vielzahl symptomatischer Therapien, wobei nur eine strikte Vermeidung des Allergens effektiv das Auftreten von Symptomen verhindert bzw. zum Abklingen der Symptome führt. Nahrungsmittelallergien können systemische Anaphylaxis auslösen oder sich in den verschiedensten Organen manifestieren, wie z.B. im Auge (allergische Bindehautentzündung), in der Nase (allergische Rhinitis), auf der Haut (Atopische Dermatitis), in der Lunge (Asthma) oder im Darm (nahrungsmittelinduzierte gastrointestinale Allergie/Enteropathie). Zur Erforschung der zugrundeliegenden immunologischen Mechanismen einer Nahrungsmittelallergie eignen sich Mausmodelle besonders. Des Weiteren werden sie für die vor-klinische Testung von neuartigen Therapien genutzt, bevor diese in klinischen Studien am Menschen getestet werden. Es existieren bereits einige Mausmodelle, die IgE-vermittelte Nahrungsmittelallergien abbilden, jedoch nur sehr wenige, die auch nicht-IgE-vermittelte Phänotypen repräsentieren. Allergische Manifestationen im Darm sind divers und noch unzureichend verstanden. Zumeist sind sehr junge Kinder betroffen. Es konnte jedoch interessanterweise beobachtet werden, dass viele dieser Kinder die Allergie spontan mit steigendem Alter wieder verlieren. Es ist noch nicht klar, welche Mechanismen in diesen Patienten zur Wiederherstellung der Toleranz führen. In der vorgelegten Doktorarbeit wurde ein neuartiges Mausmodel der nahrungsmittelinduzierten Allergie mit entzündlicher Ausprägung im Darm etabliert und analysiert. BALB/c Mäuse wurden mittels intraperitonealer Injektion von Ovalbumin (ein Hauptallergen des Eiweiß, Gal D2), absorbiert an ALUM, sensibilisiert. Die Injektionen fanden in einem Interval von zwei Wochen statt. Zwei Wochen nach der letzten Injektion wurde das konventionelle gegen ein eiweißhaltiges Futter (EW-Diät) ausgetauscht und konstant über eine Periode von sieben oder 28 Tagen den Mäusen verfüttert. Ein erstes interessantes Ergebnis wurde durch die Analyse des Gewichtsverlaufes während der Diät erhalten. In den ersten sieben Tagen zeigten die Mäuse einen zunehmenden Gewichtsverlust und weitere optische Zeichen einer Erkrankung, wie z.B. gesträubtes Fell oder weichen bis schleimigen Stuhl, sowie verminderte Aktivität. Bemerkenswerterweise war dieser Zustand nicht konstant, spontan zeigte sich Besserung der Symptome bis zur Genesung wenn die Provokation auf bis zu 28 Tage verlängert wurde. Eine Analyse der allergenspezifischen IgE-Antikörper zeigte eine deutliche Induktion am siebten Tag der Diät. Die verlängerte Fütterung führte jedoch zu einer leichten Reduktion dieser Werte (das initiale Basalniveau wurde jedoch nicht erreicht). Gleichzeitig mit absinkendem IgE-Gehalt im Serum wurde ein ansteigender Level allergenspezifischer IgG1-Antikörpern gemessen. Neben der humoralen Immunantwort wurde ebenfalls die T-Zell-vermittelte Immunantwort in der Milz und den mesenterialen Lymphknoten untersucht. Eine erhöhte Proliferation und Zytokin-Sekretion (IL-4, IL-10) nach Stimulierung mit OVA in vitro konnte nur in CD4+ T-Zellen beobachtet werden, die aus den mesenterialen Lymphknoten von sensibilisierten und mit eiweißhaltiger Diät gefütterten Mäusen isoliert wurden. Humorale- und T-Zellantwort zusammengenommen, bestätigte die Induktion einer dominanten Th2-Immunantwort. Nach 28 Tagen EW-Diät war nicht nur der Gehalt an allergenspezifischen IgE-Antikörpern reduziert, auch die T-Zellantwort war signifikant reduziert. Die Daten der CD4+ T-Zellen aus der Milz zeigten weder erhöhte Proliferation noch Zytokin-Sekretion nach Allergenstimulierung in vitro. Aus diesen Daten kann resümiert werden, dass die Strategie des verlängerten, konstanten Fütterns der allergenhaltigen Diät systemisch als auch lokal T-Zell Toleranz induzierte. Die kontinuierliche Provokation mit einer allergenhaltigen Diät entspricht in groben Zügen einer oralen Immuntherapie, die zur Zeit als alternative Therapie zur Behandlung von Nahrungsmittelallergien diskutiert wird. Im Folgenden wurde der Zustand des Darms mittels histologischer Schnitte und verschiedenen Färbungen untersucht. Nach sieben Tagen EW-Diät konnte in OVA-sensibilisierten Mäusen eine akute Entzündung im Dünndarm festgestellt werden. Davon waren alle Bereiche des Dünndarms (Duodenum, Jejunum und Ileum), jedoch nicht der Dickdarm betroffen. Bei der Analyse der Gewebeproben des Darms nach 28 Tagen kontinuierlicher EW-Diät konnte in Jejunum-Proben eine noch weiter fortgeschrittene Entzündung festgestellt werden, wobei in den anderen untersuchten Teilen des Dünndarms keine Entzündung mehr festzustellen war. Dies war ein sehr interessantes und überraschendes Ergebnis, es zeigte, dass, obwohl T-Zell-Toleranz etabliert werden konnte, eine lokale Entzündung im Darm nicht unter Kontrolle gebracht werden konnte und sogar eine Verstärkung der Entzündung auftrat. In der Maus generierte Daten können natürlich nicht eins zu eins auf den Menschen übertragen werden. Trotzdem könnte dies jedoch ein Hinweis sein, dass Patienten mit einer im Darm manifestierten, nahrungsmittelinduzierten Allergie, unter oraler Immuntherapie, besonders überwacht werden sollten, hinsichtlich einer möglichen verstärkten Entzündung im Darm, verursacht durch die Therapie. In den darauffolgenden Experimenten wurde daher der Frage nachgegangen, welche Effektor-Mechanismen im hier vorgestellten Model der gastrointestinalen Allergie eine Rolle spielen. Einen ersten Hinweis lieferte die Analyse eines Aktivierungsmarkers für Mastzellen im Serum der Mäuse. In sensibilisierten und mit EW-Diät gefütterten Mäusen war eine signifikante Erhöhung des mMCP-1 Gehalts (mouse mast cell protease-1) detektiert worden, die auch über die verlängerte Provokation mit EW-Diät nicht abnahm. Diese Ergebnisse wurden durch die histologische Färbung für Mastzellen unterstützt, die zeigte, dass Mastzellen nach sieben Tagen vereinzelt im Gewebe vorliegen, jedoch in wesentlich höherer Anzahl nach 28 Tagen. Mastzellen, als Teil des angeborenen Immunsystems, sind wichtige Effektor-Zellen in der IgE-vermittelten Allergie. Die IgE-vermittelte Verkreuzung zweier FcεRI Moleküle auf der Oberfläche der Mastzellen führt zur sofortigen Aktivierung und Sekretion vorgeformter Entzündungsmediatoren und der Produktion von neu-synthetisierten Faktoren. Der Einfluss der IgE-FcεRI-vermittelten Mastzell-Aktivierung auf den in der Maus beobachteten Phänotyp wurde mit Hilfe FcεRI-defizienter Mäuse untersucht. In diesen Mäusen ist die IgE-FcεRI-vermittelte Mastzell-Aktivierung nicht möglich. Die Mäuse wurden wie beschrieben sensibilisiert und mit EW-Diät provoziert. Ein erster Unterschied zu den Wildtyp-Mäusen wurde bei der Analyse des Gewichts festgestellt, als nur ein sehr geringer Provokations-induzierter Gewichtsverlust beobachtet werden konnte. Dies implizierte, dass der beobachtete Gewichtsverlust in den ersten sieben Tagen der EW-Diät eine IgE bzw. FcεRI-abhängige Reaktion ist. Bei den allergenspezifischen Antikörpern konnte zunächst kein Unterschied zu den Wildtyp-Mäusen festgestellt werden. Auch die T-Zell-vermittelte Immunantwort zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Maus-Stämmen. Zusammengefasst zeigten diese Resultate, das allein die Präsenz von IgE kein Toleranz-inhibierender Faktor ist, da systemisch als auch lokal T-Zell-Toleranz induziert wurde. Aufgrund der zuvor in den Wildtyp-Mäusen erhaltenen histologischen Ergebnisse wurde in den folgenden Experimenten nur das Jejunum des Dünndarms untersucht. Eine Analyse des Jejunums von FcεRI-defizienten Mäusen nach Sensibilisierung und siebentägiger EW-Diät zeigte zu unserer Überraschung eine vergleichbare Entzündung des Gewebes, wie zuvor in den Wildtyp-Mäusen beobachtet. Dies lies vermuten, dass die Entzündung, sichtbar nach den ersten sieben Tagen der Provokation, eine von dem Vorhandensein des FcεRI-Rezeptors unabhängige Reaktion ist. Weiterhin implizierte es, das die IgE-vermittelte Mastzell-Aktivierung ebenfalls keine Rolle für das Entstehen der Entzündung spielt. Damit konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass alternative Wege der Mastzell-Aktivierung, wie z.B. Zytokine oder IgG-Antikörper hier einen Einfluss haben. Sehr wahrscheinlich ist jedoch, dass der Einfluss von Effektor-T-Zellen im Gewebe zu dem beobachteten Phänotyp geführt hat. Bei der Untersuchung des Jejunum-Gewebes nach 28 Tagen EW-Diät stellte sich heraus, dass sich die FcεRI-/- Mäuse von der Entzündung erholt hatten. Es wurden keine typischen Entzündungszeichen, wie Verdickung der Basallamina, Becherzell-Hyperplasie, Verlängerung der Krypte oder ein Verlust der Zotten-Struktur, wie zuvor in Wildtyp-Mäusen beobachtet wurde, festgestellt. Diese Ergebnisse wurden weiterhin durch die mMCP-1 Daten aus dem Serum der OVA-sensibilisierten und provozierten FcεRI-defizienten Mäuse unterstrichen. mMCP-1 wurde dzunächst auf ein vergleichbares Level induziert, jedoch führte kontinuierlich fortgeführter Provokation zu einer stetigen und signifikanten Abnahme. Dies zeigte, dass der beobachtete Gewichtsverlust und die Chronifizierung der allergischen Entzündung im Darm, jedoch nicht die initiale Entzündung im Darm eng mit der Präsenz des FcεRI und damit mit IgE-induzierten Mechanismen zusammenhängt. In einem fortführenden Experiment wurden Mastzellen mittels intravenöser Injektion eines Anti-ckit-Antikörpers depletiert, was ebenfalls dazu führte, dass kein Gewichtsverlust oder andere Erkrankungserscheinungen zu beobachten waren. Die Detektion erhöhter Mengen des immunsuppressiv wirkenden IL-10 im Überstand von allergenstimulierten CD4+ T-Zellen aus sensibilisierten und provozierten Mäusen, veranlasste die Vermutung das regulatorische T-Zellen in der Erholungsphase und der Induktion der T-Zell-Toleranz auf systemischer und lokaler Ebene eine herausragende Rolle spielen. Um der Frage nachzugehen, welche regulatorischen Prozesse in diesem Mausmodell eine Rolle spielen, wurden IL-10-/- Mäuse verwendet. Sie wurden sensibilisiert und provoziert wie beschrieben und zeigten nach sieben Tagen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen einen noch massiveren Gewichtsverlust, einhergehend mit einem augenscheinlich schlechteren Gesamtbefinden der Tiere. Dies deutete darauf hin, das IL-10 einen protektiven Einfluss in der initialen Phase der allergischen Reaktion hat. Interessanterweise, erholten sich die Mäuse in vergleichbarer Art und Weise wie die Wildtyp-Mäuse wieder von den am Beginn der Provokation gezeigten Anzeichen einer allergischen Erkrankung. Die Analyse der allergenspezifischen Antikörper zeigte eine sehr geringe und nicht signifikante Induktion der IgE-Antikörper, eine niedrigere Menge an IgG1-Antikörpern, aber erhöhte Mengen an IgG2A Antikörpern. Auch die T-Zell-vermittelte Immunantwort untersucht anhand der CD4+ T-Zellen der Milz und mesenterialen Lymphknoten zeigte auffällige Unterschiede, vor allem in Form erhöhter IFN-γ Mengen. Diese Ergebnisse passten jedoch in die Literatur, die zu IL-10-/- Mäusen veröffentlich wurde. Darin wurde für diese Mäuse eine spontane durch Th1 und Th17-Immunantworten-vermittelte, Kolitis beschrieben. Daher werden diese Mäuse auch bevorzugt für „Inflammatory Bowel Disease“-Modelle verwendet. Dieser Th1-dominierte Hintergrund in den Mäusen macht es schwierig, eine Th2-vermittelte allergische Reaktion zu etablieren, daher konnte auch nur eine wesentlich moderatere entzündliche Veränderung im Darmgewebe festgestellt werden. Die Vermutung liegt nahe, dass die Th1-orientierten Immunprozesse in der Maus, mit denen durch die Behandlung induzierten Th2-orientierten Immunantworten sich gegenseitig inhibierten. Dies führte weiterhin zu der Schlussfolgerung, dass die in dieser Maus erhaltenen Ergebnisse nur schwierig in das Gesamtbild zu integrieren waren. Zusammenfassend kann jedoch gefolgert werden, dass die Erholung von den anfänglichen Erkrankungserscheinungen unabhängig von IL-10 auftreten kann und dass T-Zell-Toleranz IL-10 unabhängig etabliert werden kann. In einem weiteren Experiment sollte die Frage geklärt werden, ob in unserem Mausmodell funktionelle regulatorische T-Zellen induziert wurden. Für die Isolation der CD4+CD25+ T-Zellen wurde der siebte Tag nach Provokationsbeginn gewählt, da dieser einen Übergang von akuter allergischer Antwort zur Genesung zeigt. Um die Funktionalität der regulatorischen T-Zellen zu überprüfen, wurde ein Proliferations-Inhibitions-Test durchgeführt wofür CD4+CD25+ und CD4+CD25- T-Zellen zusammen kultiviert (unter Stimulierung mit Allergen) und die Proliferation gemessen wurde. Es zeigte sich das die Proliferation von CD4+CD25- T-Zellen effektiv durch Co-Kultivierung mit CD4+CD25+ T-Zellen inhibiert werden konnte. Dies wies darauf hin, dass nicht nur allergenspezifischen Effektor T-Zellen induziert wurden, sondern auch funktionelle, allergenspezifische regulatorische T-Zellen. Ein weiterer toleranz-induzierender Mechanismus, der in diesem Mausmodell durchweg beobachtet werden konnte, ist die T-Zell-Depletion, welche durch hohe Antigen-Dosen vermittelt wird. Dafür wurde die Häufigkeit der CD4+ T-Zellen mittels FACS ermittelt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Anzahl der CD4+ T-Zellen mit fortschreitender Provokation immer mehr abgenommen hat. Unter klinischen Allergologen wird intensiv debattiert ob orale Immuntherapie effektiv orale Toleranz wiederherstellen kann. Zurzeit gibt es leider kaum Langzeitstudien die dieser Frage nachgegangen sind, es wird daher davon ausgegangen das OIT zu einem gewissen Grad Desensibilisierung aber nicht Toleranz herstellt. Der Patient kann dabei nach einer Therapie eine erhöhte Menge des Allergens zu sich nehmen ohne Symptome zu entwickeln. Auch mit der Hilfe des hier etablierten Mausmodells wurde der Frage nachgegangen, ob persitierende orale Toleranz induziert worden ist. Dafür wurden die Mäuse sensibilisiert und provoziert für zwei oder vier Wochen, danach wurde die Allergenhaltige-Diät für zwei oder vier Wochen unterbrochen und danach wieder begonnen. Nach einer Woche erneuter Provokation, wurde wieder ein massiver Gewichtsverlust, erhöhte allergenspezifische IgE-Antikörper, erhöhte Mastzell-Aktivierung und allergenspezifische T-Zell-Aktivität festgestellt. Aus diesen Daten lässt sich schlussfolgern, dass die kontinuierliche Provokation mit dem Allergen, zwar augenscheinliche Symptome und auch allergenspezifische IgE-Antikörper reduziert, auf T-Zell-Ebene systemisch und lokal zu Toleranz führt, dies jedoch nicht zwingend persistierende Effekte sind. Die in dieser Arbeit präsentierten Daten zeigten die Etablierung eines neuartigen Mausmodels einer im Darm manifestierten nahrungsmittel-induzierten Allergie. Dieses Modell wurde charakterisiert und zeigte, dass sowohl Mastzell-abhängige als auch unabhängige z.B. T-Zellvermittelte Prozesse in diesem Modell eine entscheidende Rolle spielen. Es konnte gezeigt werden, dass kontinuierliche Allergen-Provokation, wie üblich während oraler Immuntherapie, zu einer verstärkten Entzündung im Darm führen kann. Jedoch gleichzeitig systemisch und lokal T-Zell-Toleranz induziert werden konnte. Des Weiteren wurde die derzeitige Literatur bezüglich der Effekte oraler Immuntherapie in immunologischer Hinsicht bestätigt. Dies unterstreicht, dass dieses Modell für die Analyse von Effektor und regulatorischen Mechanismen geeignet ist und auch teilweise geeignet ist für die Untersuchung zugrundeliegender Mechanismen der oralen Immuntherapie. Des Weiteren eignet sich dieses Modell aufgrund des ausgeprägten allergischen Phänotyps ebenfalls für die Testung alternativer Therapieformen.