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Jatin Nagpal

• Optogenetics, though still only a decade old field, has revolutionized research in neurobiology. It comprises of methods that allow control of neural activity by light in a minimally-invasive, spatio-temporally precise and genetically targeted manner. The optogenetic actuators or the genetically encoded light sensitive elements mediate light driven manipulation of membrane potential, intracellular signalling, neuronal network activity and behaviour (Fenno et al. 2011; Dugué et al. 2012). These techniques have been particularly useful for dissecting neural circuits and behaviour in the transparent and genetically amenable nematode model system Caenorhabditis elegans (Husson et al. 2013; Fang-yen et al. 2015). In fact, C. elegans was the first living organism in which microbial rhodopsin based optogenetic tools (Channelrhodopsin-2 or ChR2, and Halorhodopsin or NpHR) were successfully implemented and bimodal 'remote' control of behaviour was achieved (Nagel et al. 2005; Zhang et al. 2007). Since then it has been a prominent model for the development and application of novel optogenetic tools and techniques, especially in the nervous system which comprises of 302 neurons and is organised in a hierarchical organization. The environmental stimuli are sensed by the sensory neurons, leading to the processing of information by the downstream interneurons, that relay to motor neurons which in-turn synapse onto muscles that drive the movement-based responses. The microbial rhodopsins like ChR2 and NpHR mediate light driven depolarization and hyperpolarization, respectively and thereby activate or inhibit neural activity. However, they do not allow local control of membrane potential as they are expressed all over the plasma membrane of the cell rather than being restricted to specific domains, for example synaptic sites. Moreover, they completely over-ride the intrinsic activity of the cell, completely bypassing the signal transduction processes inside the cell. Thus, in order to study intracellular signalling and to answer questions pertaining to the endogenous role of receptors and channels in an in-vivo context, the optogenetic tool-kit needs to be expanded. This thesis aimed at developing and implementing novel optogenetic tools in C. elegans that allow for sub-cellular signalling control as well as endogenous receptor control. These are: two light activated guanylyl cyclases (bPGC and BeCyclOp) to modify cyclic guanosine monophosphate (cGMP) mediated signalling in the sensory neurons, as well as attempts towards rendering endogenous C. elegans receptors - glutamate receptor (GLR-3/-6), acetylcholine receptor (ACR-16), glutamate gated chloride channel (GLC-1) light switchable and to understand their biological function in-vivo. Organisms respond to sensory cues by activation of a primary receptor followed by relay of information downstream to effector targets by secondary signalling molecules. cGMP is a widely used 2nd messenger in cellular signaling, acting via protein kinase G or cyclic nucleotide gated (CNG) channels. In sensory neurons, cGMP allows for signal modulation and amplification, before depolarization. Chemo-, thermo-, and oxygen-sensation in C. elegans involve sensory neurons that use cGMP as the main 2nd messenger. For example, ASJ is the pheromone sensing neuron regulating larval development, AWC is the chemosensory neuron responding to volatile odours and BAG senses oxygen and carbon dioxide in the environment. In these neurons, cGMP acts downstream of the GPCRs and functions by activating cationic TAX-2/-4 CNG channels, thereby depolarising the sensory neuron. Manipulating cGMP levels is required to access signalling between sensation and sensory neuron depolarization, thereby provide insights into signal encoding. We achieve this by implementing two photo-activatable guanylyl cyclases - 1) a mutated version of Beggiatoa sp. bacterial light-activated adenylyl cyclase, with specificity for GTP (Ryu et al. 2010), termed BlgC or bPGC (Beggiatoa photoactivated guanylyl cyclase) and 2) guanylyl cyclase rhodopsin (Avelar et al. 2014) from Blastocladiella emersonii (BeCyclOp). bPGC is a BLUF (blue light sensing using flavin) domain containing cyclase which uses FAD as the co-factor and catalyses the synthesis of cGMP from GTP upon activation by blue light. Prior to implementation in sensory neurons, a simpler heterologous system with co-expression of the TAX-2/-4 CNG channel in C. elegans body wall muscle (BWM) was used. The cGMP generated by the light activated cyclases activates the CNG channel leading to the muscle depolarization, thereby causing changes in body length which can be easily scored.
• Obwohl die Optogenetik ein nur zehn Jahre altes Forschungsgebiet ist, hat sie die Forschung in der Neurobiologie revolutioniert. Sie umfasst Methoden, die die Kontrolle neuronaler Aktivität durch Licht in einer minimal-invasiven, räumlich und zeitlich präzisen, und genetisch gezielten Weise ermöglichen. Die optogenetischen Aktoren, auch als genetisch codierte, lichtempfindliche Elemente zu beschreiben, ermöglichen, durch Licht angetrieben, die Manipulation von Membranpotentialen, von intrazellulären Signalwegen, sowie von neuronalen Netzwerkaktivitäten und Verhalten (Fenno et al. 2011; Dugué et al. 2012). Diese Techniken haben sich als besonders nützlich für die Sektion von neuronalen Schaltkreisen und des Verhaltens in der Nematode Caenorhabditis elegans erwiesen; einem transparenten und genetisch zugänglichen Modellsystem (Husson et al. 2013; Fang-yen et al. 2015). Tatsächlich ist C. elegans der erste Organismus, in dem auf mikrobiellem Rhodopsin basierende optogenetische Werkzeuge (Channelrhodopsin-2 oder ChR2 und Halorhodopsin oder NpHR) erfolgreich implementiert wurden und so auch eine bimodale ferngesteuerter Kontrolle des Verhaltens erreicht wurde (Nagel et al. 2005; Zhang et al. 2007). Seitdem ist der Nematode ein hervorragendes Modell für die Entwicklung und Anwendung von neuartigen optogenetischen Werkzeugen und Techniken, vor allem in seinem Nervensystem, welches aus 302 Neuronen besteht und in einer hierarchischen Weise organisiert ist. Stimuli aus der Umgebung werden von den sensorischen Neuronen erkannt, führen zu einer Weiterleitung der Informationen durch die stromabwärts liegenden Interneuronen zu den Motorneuronen, welche synaptisch mit den Muskeln verbunden sind und dort eine bewegungsbasierte Reaktion erwirken. Mikrobielle Rhodopsine wie ChR2 und NpHR vermitteln jeweils Licht angetriebene Depolarisation und Hyperpolarisation, wodurch sie neuronale Aktivität induzieren oder unterdrücken. Sie erlauben jedoch keine lokale Kontrolle des Membranpotentials, da sie überall in der Plasmamembran der Zellen exprimieren und deswegen nicht auf bestimmte Domänen beschränkt sind, wie beispielsweise in den Synapsen. Zudem überschreiten sie die intrinsische Aktivität der Zelle und umgehen so auch die Signaltransduktionsprozesse innerhalb der Zelle. Somit muss, um die intrazellulären Signalwege zu studieren und um die Fragen über die endogene Rolle von Rezeptoren und Kanälen in einem in vivo Kontext zu beantworten, die Sammlung optogenetischer Werkzeuge erweitert werden. Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung und Umsetzung neuartiger optogenetischer Werkzeuge in C. elegans, welche die Kontrolle der subzellulären Signalsteuerung sowie die von endogenen Rezeptoren ermöglichen. Diese sind: zwei Licht-aktivierte Guanylylzyklasen (bPGC und BeCyclOp), um die durch zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) vermittelten Signalwege in den sensorischen Neuronen zu modifizieren, sowie Versuche die endogenen C. elegans Rezeptoren - Glutamatrezeptor (GLR-3/-6), Acetylcholin - Rezeptor (ACR-16) und Glutamat gesteuerter Chlorid - Kanal (GLC-1) lichtschaltbar zu machen und ihre biologische Funktion in vivo zu verstehen. Organismen reagieren auf sensorische Signale durch die Aktivierung eines primären Rezeptors, gefolgt von der Übertragung der Information stromabwärts durch sekundäre Signalisierungsmoleküle zum Wirkungsort. cGMP ist ein weit verbreiteter sekundärer Botenstoff in der zellulären Signaltransduktion, der über Proteinkinase G oder zyklische Nukleotid gesteuerte (CNG) Kanäle wirkt. In sensorischen Neuronen ermöglicht cGMP vor einer Depolarisation eine Modulation und Verstärkung des Signals. Die Chemo-, Thermo- und Sauerstoff-Erkennung in C. elegans involviert die sensorischen Neuronen, welche hauptsächlich cGMP als sekundären Botenstoff benutzen. Zum Beispiel reguliert das Pheromon erkennende ASJ Neuron die Larvenentwicklung, reagiert das chemosensorische Neuron AWC auf flüchtige Gerüche und BAG detektiert Sauerstoff und Kohlendioxid in der Umgebung. In diesen Neuronen wirkt cGMP stromabwärts der GPCRs und aktiviert die kationischen TAX-2/-4 CNG - Kanäle, wodurch die sensorischen Neuronen depolarisiert werden. Die Manipulation der cGMP Niveaus ist erforderlich um auf die Signale zwischen Reizerkennung und Depolarisation von sensorischen Neuronen zuzugreifen und Einblick in die Signalkodierung zu erlangen. Dies erreichen wir durch das Implementieren zweier photoaktivierbarer Guanylylzyclasen - 1) einer mutierten Version der Beggiatoa sp bakteriellen, lichtaktivierten Adenylatzyklase, mit Spezifität für GTP (Ryu et al. 2010), die BlgC oder bPGC genannt wird (Beggiatoa photoaktivierte Guanylylzyklase) und 2) einem Guanylatzyklase-Rhodopsin (Avelar et al. 2014) von Blastocladiella emersonii (BeCyclOp).