Open Access

Jennifer Stefani

• In the adult mammalian brain stem cells within defined neurogenic niches retain the capacity for lifelong de novo generation of neurons. The subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles and the subgranular layer (SGL) of the hippocampal dentate gyrus (DG) have been identified as the two major sites of adult neurogenesis. Moreover, the third ventricle in the hypothalamus is emerging as a new neurogenic niche in the adult brain. Extracellular purine and pyrimidine nucleotides are involved in the control of both embryonic and adult neuro-genesis. These nucleotides act via ionotropic P2X or metabotropic P2Y receptors and studies of the adult SVZ and the DG provide strong evidence that ATP promotes progenitor cell proliferation in this stem cell rich regions. Previous studies have shown that the extracellular nucleotide-hydrolyzing enzyme NTPDase2 is highly expressed by adult neural stem and progenitor cells of the SVZ and the rostral migratory stream (RMS), the hippocampal SGL, and the third ventricle. NTPDase2 preferentially hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates (NTPs) and, to a lower extent, diphosphates, thus modulating their effect on nearby nucleotide receptors. Deletion of the enzyme increases extracellular NTP concentrations, and might indicate roles of purinergic signaling in adult neurogenesis. As shown by enzyme histochemistry, genetic deletion of NTPDase2 essentially eliminates ATPase activity in neurogenic niches but does not affect protein expression levels and activity of other ectonucleotidases. Lack of NTPDase2 leads to expansion of the hippocampal stem cell pool as well as of the inter-mediate progenitor type-2 cells. Cell expansion is lost at around type-3 stage, paralleled by increased labeling for caspase-3, indicating increased apoptosis, and decreased levels in CREB phosphorylation in doublecortin-expressing cells, diminishing survival in this cell population. In line with increased cell death, P2Y12 receptor-expressing microglia is enriched at the hilus orientated side of the granule cell layer. These data strongly suggest that NTPDase2 functions as central homeostatic regulator of nucleotide-mediated neural progenitor cell proliferation and expansion in the adult brain by balancing extracellular nucleotide concentrations and activation of purinergic receptors. In order to further characterize the role of purinergic signaling in adult neurogenesis, the ADP-sensitive P2Y13 receptor was identified as a potential candidate whose activation might inhibit neurogenesis in the hippocampal dentate gyrus and the newly identified neurogenic niche at the third ventricle. Deletion of P2ry13 increased progenitor cell proliferation and long-term progenitor survival as well as new neuron formation in the hippocampal neurogenic niche. This was further paralleled by increased thickening of the granule cell layer, CREB phosphorylation, and expression of the neuronal activity marker c-Fos. Increased progenitor cell proliferation and progenitor survival persist in aged P2ry13 knockout animals. However, in the ventral dentate gyrus proliferation and expansion levels of progenitor cells did not differ significantly from the wild type. This study strongly supports the notion that extracellular nucleotides significantly contribute to the control of adult neurogenesis in the dentate gyrus in situ. Data in this work suggest that activation of the P2Y13 receptor dampens progenitor cell proliferation, new neuron formation, and neuronal activity. In contrast to several in vitro studies and studies in the SVZ in situ, a contribution of the ATP/ADP-sensitive P2Y1 receptor could not be confirmed in the dentate gyrus in vivo. To unravel implications of purinergic signaling and P2Y13 receptor action in the control of adult hypothalamic neurogenesis a pilot study was performed. Mice null for P2ry13 revealed increased progenitor cell proliferation at the third ventricle as well as long-term progeny survival and new neuron formation in the hypothalamus. In contrast to results obtained in the dentate gyrus expression of the neuronal activity marker c-Fos was significantly decreased in hypothalamic nuclei, indicating increased inhibition of appetite-regulating neuronal circuits by surplus neurons in knockout animals. These data provide first evidence that extracellular nucleotide signaling contributes to the control of adult hypothalamic neurogenesis in situ. Activation of the P2Y13 receptor inhibits progenitor cell proliferation, long-term survival and neuron formation and therefore controls inhibition of appetite-regulating circuits in the adult rodent hypothalamus.
• Im erwachsenen Säugerhirn behalten Stammzellen, in neurogenen Nischen, die Fähigkeit bei, sich zu teilen und reife Nerven- oder Gliazellen hervorzubringen. Diese neurogenen Nischen sind die subventrikuläre Zone (SVZ) am Seitenventrikel und die subgranuläre Zone (SGZ) im Gyrus dentatus (GD) des Hippokampus. Zudem häufen sich die Hinweise auf die Existenz weiterer neurogener Nischen, unter anderem am dritten Ventrikel im Hypothalamus. Extrazelluläre Nukleotide können im zentralen Nervensystem von Säugern von einer Vielzahl von Zellen freigesetzt werden. Sie fungieren als extrazelluläre Signalmoleküle, die ihre Wirkung über ionotrope oder metabotrope Rezeptoren vermitteln, welche sich in ihrer Ligandenspezifität unterscheiden. Membranständige Enzyme, sogenannte Ekto-Nukleotidasen, hydrolysieren extrazelluläre Nukleotide, verändern deren Verfügbarkeit und modifizieren intrazellulär ausgelöste Signalwege. Vorangegangene Studien zeigten, dass die Ekto-Nukleotidase NTPDase2 auf primären Stammzellen in der SVZ und SGZ exprimiert wird. NTPDase2 hydrolysiert extrazelluläres ATP und, zu einem geringeren Teil, ADP. Daher dürfte die Akkumulation extrazellulären ATPs in neurogenen Nischen nach Deletion der NTPDase2 erhöht sein und Hinweise auf die Rolle extrazellulärer Nukleotide an der Kontrolle der adulten Neurogenese liefern. Mittels enzymhistochemischer Detektion von ATPase-Aktivität wurde die NTPDase2 als Haupt-enzym für die Hydrolyse extrazellulärer Nukleotide in neurogenen Nischen identifiziert. Semi-quantitative Western-Blot-Analysen stützen die Beobachtung, dass die Deletion der NTPDase2 keine kompensatorische Überexpression anderer nukleotidhydrolysierender Enzyme zur Folge hat. Mittels immunhistochemischer Methoden wurde eine erhöhte Expansion von Vorläuferzellen in NTPDase2-/- Mäusen nachgewiesen. Die Zahl unreifer Neuronen war hingegen zwischen Wildtyp- und Knockout-Mäusen unverändert. Zudem war die Apoptoserate in NTPDase2-/- Mäusen erhöht. Dies deutet darauf hin, dass interne regulatorische Mechanismen ein Überleben junger Neuronen verhindern. Gestützt wird diese These von Daten dieser Arbeit, die belegen, dass das Ausmaß der Phosphorylierung von CREB (cAMP response-element binding protein) in unreifen Neuronen von Knockout-Mäusen erniedrigt war, was auf einen Verlust von Überlebensfaktoren hindeutet. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass die NTPDase2 als homöostatischer Regulator der Nukleotid-vermittelten Proliferation und Ausdehnung von Vorläuferzellen im GD des Hippokampus fungiert. Sie dürfte die Aktivierung pro-mitotisch und anti-mitotisch wirkender Signalwege über die Kontrolle extrazellulärer Nukleotidkonzentrationen und entsprechender purinerger Rezeptoraktivierung kontrollieren. Der ADP-sensitive P2Y13-Rezeptor wurde als Kandidat ausgemacht, der anti-mitotische Signalwege vermitteln könnte. Inkorporationsanalysen des Thymidinanalogons BrdU (Bromodesoxyuridin) zeigten eine erhöhte Anzahl BrdU-markierter Zellen in der SGZ von P2ry13 Knockout-Mäusen. Das Überleben dieser Zellen war signifikant erhöht und eine Verdopplung der Anzahl neugebildeter Neuronen konnte nachgewiesen werden. Begleitet wurden diese Effekte von einer Verdickung der Körnerzellschicht, einer erhöhten Phosphorylierungsrate von CREB in Neuroblasten, sowie einer erhöhten neuronalen Aktivität im GD in situ. Im ventralen GD wurde keine Erhöhung der Proliferation/des Überlebens von Vorläuferzellen detektiert, was auf eine regionenspezifische Expression des Rezeptors hindeuten könnte. Ein durch den ATP/ADP-sensitiven P2Y1-Rezeptor vermittelter proliferativer Effekt, der in vorangegangenen Studien in der SVZ nachgewiesen wurde, ließ sich im vorliegenden in vivo-Modelsystem nicht nachweisen. Die Daten dieser Studie stützen die These, dass die kontrollierte Aktivierung von pro-mitotisch und anti-mitotisch wirkenden purinergen Rezeptoren, vermutlich vermittelt durch die katalytische Aktivität der NTPDase2, eine funktionelle Rolle bei der adulten hippokampalen Neurogenese spielt. In dieser Arbeit wurde zudem gezeigt, dass die Deletion des P2Y13-Rezeptors die Proliferation und Neurogenese am dritten Ventrikel erhöht. In allen drei hypothalamischen Nuklei (dorsomedialer und ventromedialer Nukleus sowie Nucleus arcuatus) war zudem das Aktivitätsniveau in P2Y13–Rezeptor-Knockout-Mäusen erniedrigt. Dies deutet auf eine verstärkte inhibierende Wirkung von neugebildeten Neuronen auf Appetit-regulierende neuronale Netzwerke im Hypothalamus hin. Die Daten legen eine Beteiligung purinerger Signalmechanismen, insbesondere des P2Y13-Rezeptors, an der adulten hypothalamischen Neurogenese und an der Kontrolle des Energiestoffwechsels nahe. Unter physiologischen Bedingungen übt die Aktivierung des P2Y13-Rezeptors vermutlich einen negativen Effekt auf Zellproliferation, -überleben und die Bildung von Nervenzellen aus, was eine mutmaßlich verringerte inhibitorische Wirkung auf Appetit-regulierende Netzwerke im adulten murinen Hypothalamus zur Folge hat.