Open Access

Christoph Klaus Spahn

• Bacteria are highly organized organisms which are able to adapt to and propagate under a multitude of environmental conditions. Propagation hereby requires reliable chromosome replication and segregation which has to occur cooperatively with other cellular processes such as transcription, translation or signaling. Several mechanisms were proposed for segregation of the Escherichia coli (E. coli) chromosome, for example a mitotic-like active segregation model or entropy-based passive chromosome segregation. Another segregation model suggests coupled transcription, translation and insertion of membrane proteins (termed "transertion"), which links the replicating chromosome (nucleoid) to the growing cell cylinder. Fluorescence microscopy was widely used to provide evidence for a distinct segregation model. However, the dynamic nature of bacterial chromosomes, the small bacterial size and the optical resolution limit of ~ 200-300 nm impair unveiling the underlying mechanisms. With the emergence of super-resolution fluorescence microscopy techniques and advanced labeling methods, a new toolbox became available enabling scientists to visualize biomolecules and cellular processes in unprecedented detail. Single-molecule localization microscopy (SMLM) represents a set of super-resolution microscopy techniques which relies on the temporal separation of the fluorescence signal and detection of single fluorophores. Separation can be achieved using photoactivatable or -convertible fluorescent proteins (FPs) in photoactivated localization microscopy (PALM), photoswitchable organic dyes in direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) or dynamically binding fluorescent probes in point accumulation for imaging in nanoscale topography (PAINT). In all these techniques, the fluorescence emission pattern of single fluorophores is spatially localized with nanometer-precision. An artificial image is finally reconstructed from the coordinates of all single fluorophores detected. This provides a spatial resolution of ~ 20 nm, which is perfectly suited to investigate cellular processes in bacteria. In this thesis, different SMLM techniques were applied to study fundamental processes in E. coli. This includes determination of protein copy numbers and distributions as well as the nanoscale organization of nucleic acids and lipids. A novel labeling approach was applied and used for super-resolution imaging of the E. coli nucleoid. It is based on the incorporation of the modified thymidine analogue 5-ethynyl-2’- deoxyuridine (EdU) into the replicating chromosome. Azide-functionalized organic fluorophores can be covalently attached to the ethynyl group of incorporated EdU bases using a copper-catalyzed "click chemistry" reaction. Under the investigated growth condition, E. coli cells exhibited overlapping replication cycles, which is commonly referred to as multi-fork replication and enables cells to divide faster than they can replicate the entire chromosome. dSTORM imaging of such labeled nucleoids revealed chromosome features with diameters of 50 - 200 nm, representing highly condensed DNA filaments. Sorting single E. coli cells by length allowed visualizing structural changes of the nucleoid throughout the cell cycle. Replicating nucleoids segregated and expanded along the bacterial long axis, while constantly covering the entire width of the cell. Measuring cell and nucleoid length revealed a relative nucleoid expansion rate of 78 ± 6 %. At the same time, nucleoids populated 63 ± 8 % of the cell length, almost exclusively being localized to the cylindrical part of the cell. This value was hence normalized to the cylindrical fraction of the cell, yielding a value of 79 ± 10 % (nucleoid-populated fraction of the cell cylinder), which is in good agreement with the observed relative nucleoid expansion rate. These results therefore support a growth-mediated segregation model, in which the chromosome is anchored to the inner membrane and passively segregated into the prospective daughter cells upon cell growth. 3-dimensional dSTORM imaging of labeled nucleoids confirmed that compacted nucleoids helically wrap along the inner membrane. Similar results were obtained by imaging orthogonally aligned E. coli cells using a holographic optical tweezer approach. In order to visualize particular proteins together with the nucleoid, several correlative imaging workflows were established, facilitating multi-color SMLM imaging in single E. coli cells. These workflows bypass prior limitations of SMLM, including destruction of FPs by reactive oxygen species in copper-catalyzed click reactions or incompatibility of PALM imaging with dSTORM imaging buffers. A sequential SMLM imaging routine was developed which is based on postlabeling and retrieval of previously imaged cells. Optimal imaging conditions can be maintained for each fluorophore, enabling to extract quantitative information from PALM measurements while correlating the protein distribution to the nucleoid ultrastructure within the highly resolved cell envelope. Applying this workflow to an E. coli strain carrying a chromosomal rpoC - photoactivatable mCherry (PAmCh) fusion, transcribing RNA polymerase (RNAP) was found to be localized on the surface of nucleoids, where active genes are exposed towards the cytosol. During growth in nutrient-rich medium, the majority of RNAP molecules was bound to the chromosome, thus ensuring that the RNAP pool is equally distributed to the daughter cells upon cell division. This work represented the first triple-color SMLM study performed in E. coli cells. ...
• Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Organisation des Chromosoms (Nucleoid) und dessen Segregation im gram-negativen Bakteriums Escherichia coli (E. coli) mittels höchstauflösender Fluoreszenzmikroskopie. Dazu wurde die Einzelmolekül-Lokalisations-Mikroskopie (single molecule localization microscopy, SMLM) eingesetzt, welche eine räumliche Auflösung von 20 nm erreicht und gleichzeitig quantitative Informationen zur Anzahl und Verteilung von Proteinen, als auch zu Protein-Protein-Interaktionen liefert. Im ersten Teil wurde die Organisation des E. coli Nucleoids lichtmikroskopisch mit höchster Auflösung untersucht. Hierzu wurde ein Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung naszenter Desoxyribonuklein-säure (deoxyribonucleic acid, DNA) verwendet, welches auf dem Einbau des Thymidin-Analogons 5-Ethynyl-2‘-Desoxyuridin (EdU) während der Replikation basiert und nachträglich die Markierung mit Azid-konjugierten photoschaltbaren Fluorophoren mittels Click-Chemie ermöglicht. Mit diesem Verfahren konnte eine hohe Markierungsdichte erreicht werden, welche eine essenzielle Voraussetzung für SMLM darstellt. Markierte Nucleoide wurden mittels direkter stochastischer optischer Rekonstruktionsmikroskopie (direct optical reconstruction microscopy, dSTORM) hochaufgelöst, was kompakte DNA-Strukturen mit Durchmessern von lediglich 50-200 nm enthüllte. Der Vergleich unterschiedlich großer E. coli Zellen lieferte Hinweise für eine wachstumsabhängige Segregation der Schwesterchromosomen. Dreidimensionale SMLM Experimente zeigten, dass das E. coli Nucleoid hierbei eine helikale Struktur aufweist und durchgehend in der Nähe der inneren Membran lokalisiert ist. Im zweiten Teil wurde die räumliche Organisation des osmosensorischen Regulatorproteins OmpR untersucht. Dieses Protein ist Teil des EnvZ-OmpR Zweikomponentensystems, welches die Anpassung von E. coli Zellen an ungünstige Umweltbedingungen ermöglicht. Um die räumliche Organisation von OmpR mit dem E. coli Nucleoid zu korrelieren, wurden Mehrfarben-SMLM-Ansätze etabliert. Es wurde gezeigt, dass OmpR in hypertonem Medium an der Oberfläche kompakter Nucleoidstrukturen lokalisiert ist. Dort könnte es an regulatorische Gensequenzen von Porinen der äußeren Membran gebunden sein, um deren Expression zu steuern und somit osmotischem Stress entgegenzuwirken. In hypotoner und saurer Umgebung befand sich der Großteil an OmpR-Molekülen in Membrannähe. In saurem Medium konnte zudem ein ringförmig organisiertes Nucleoid beobachtet werden, welches im Zellzentrum positioniert war und über dünne DNA Filamente an die Membran gekoppelt schien. Im dritten Teil der Arbeit wurden verschiedene Modelle der Chromosomensegregation mittels Mehrfarben-SMLM getestet. Es konnte gezeigt werden, dass sich das E. coli Nucleoid in der Nähe von Zellwandsynthesekomplexen (Elongasomen) befindet und wahrscheinlich an diesen verankert ist. Elongasomen wurden hierbei über das bakterielle Aktinhomolog MreB visualisiert. Um den Mechanismus dieser Verankerung zu studieren, wurden spezifische Antibiotika zur Störung der Transkription, Translation, DNA Replikation und Zellwandsynthese eingesetzt, und die strukturelle Änderung des Nucleoids mit Bezug zur Zellwandsynthesemaschinerie visualisiert. Mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (confocal laser scanning microscopy, CLSM) und SMLM konnte gezeigt werden, dass sowohl die Inhibierung der Transkription als auch der Translation zur Loslösung des Nucleoids von Zellwandsynthesekomplexen führt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aufspannung und Verankerung des Nucleoids durch gekoppelte Transkription und Translation gewährleistet wird. Die Störung der Zellwandsynthese führte zu einer Umverteilung von MreB, beeinflusste jedoch nicht die Verankerung des Nucleoids an der Membran. Trotz Störung der MreB-Polymerisierung waren einige funktionale Zellwandsynthesekomplexe vorhanden, welche eine direkte räumliche Nähe zum Nucleoid aufwiesen. Ein Bruchteil funktionaler Komplexe könnte somit genügen, um die Organisation des E. coli Chromosoms aufrecht zu erhalten. Die kombinierte Störung von Zellwandsynthese und Transkription beziehungsweise Translation verdeutlichte, dass aller Voraussicht nach der Prozess der Translation das Nucleoid mit Elongasomen verbindet. Hierbei könnte der Translations-Elongationsfaktor EF-Tu eine Doppelrolle erfüllen, in der er sowohl zur Polymerisierung von MreB, als auch zur Elongation der Translation beiträgt und somit eine dynamische Verbindung herstellt. Die Inhibierung der DNA Replikation führte zum Loslösen einiger Elongasomen und zur Positionierung des Nucleoids in der Zellmitte. Die Zellwandsynthese wurde hierbei nicht beeinträchtigt, was in stark verlängerten E. coli Zellen mit großen, DNA-freien Regionen resultierte. Die Wiederaufnahme der Replikation führte zu einer rapiden Expansion des Nucleoids, welches daraufhin die Verbindungen zu den freien Zellwandsynthesekomplexen wiederherstellte. Diese Komplexe beziehungsweise das MreB-Zytoskelett selbst könnten somit als Gerüst dienen, welches die korrekte Positionierung der Schwesterchromosomen ermöglicht und somit wesentlich zur Chromosomenreplikation beitragen könnte. Der vierte Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit Methoden, welche es erlauben, quantitative Informationen zur Anzahl bestimmter Proteine in einzelnen Bakterienzellen zu ermitteln. Quantitative photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (photoactivated localization microscopy, PALM) wurde genutzt, um die Kopienzahl von OmpR, MreB und RNAP in schnell wachsenden E. coli Zellen zu bestimmen. Eine dichteabhängige Clusteranalyse (Density-based spatial clustering of applications with noise, DBSCAN) wurde auf PALM-Daten angewendet, um die räumliche Organisation von Transkriptionsfabriken und MreB-Filamenten zu untersuchen. Weiterhin wurde ein Analyseverfahren entwickelt, welches eine artefaktfreie Clusteranalyse von SMLM-Daten ermöglicht.