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Hannah Marie Fraser

• Die positive Entwicklung der adoptiven Zelltherapie zu einer effektiven und sicheren Therapieform ist enorm wichtig für die Behandlung von Patienten mit einer opportunistischen Infektion, wie bspw. mit CMV oder EBV, nach einer Stammzelltransplantation. Bei (CMV-)seropositiven Spendern besteht die Möglichkeit der Selektion von VST und somit eine Therapieoption für den CMV-Infizierten Empfänger. Aufgrund der nicht vorhandenen VST bei einem negativen Spender, besteht die Option einer Infusion von selektierten VSTs bei einem CMV-infizierten Empfänger nicht. Dies ist ein besonderes Problem bei seropositiven Patienten, die die Stammzellen eines seronegativen Spenders erhalten haben und bei denen die Gefahr einer Reaktivierung des Virus besonders hoch ist. Um einen möglichen Lösungsansatz hierfür zu finden, wurde in dieser Arbeit versucht Zellen zu generieren, die eine adoptive Zelltherapie bei dem oben genannten Spender/Empfänger-Konstellation ermöglichen. Der Forschungsansatz dahinter war, aus naiven T-Zellen des seronegativen Spenders, durch Priming mit einem CMV-spezifischen Antigens, in diesem Fall CMV-pp65, VST zu generieren. Um diese herstellen zu können wurden mehrere Versuchsabläufe getestet. Zunächst inkubierte man unmanipulierte PBMCs mit CMV-pp65-geprimten Monozyten in verschiedenen Koinkubation-Ratios. Dies führte nicht zum gewünschten Erfolg. In dieser Arbeit erfolgte die Selektion der Monozyten via Adhärenzmethode und mittels Microbeads. Da die Monozytenreinheit nachweislich Microbeads-Methode signifikant höher war, als die Reinheit mittels der Adhärenzmethode verließ man diese und arbeitete nur noch mit Microbeads, um ein besseres Verhältnis der Koinkubation zu erzielen. Um einen möglichen Erfolg zu erzielen wurden in einem nächsten Schritt die selektierten Monozyten zu dendritischen Zellen (DC) weiterentwickelt und wiederum mit unmanipulierten PBMCs inkubiert. Leider konnten auch mit dieser Herangehensweise keine VST in der Zellkultur nachgewiesen werden. Weiterführend orientierte man sich in dieser Arbeit an einem Protokoll von Wölfl et al46. Hierbei wurden statt unmanipulierten PBMCs, nur CD45RA+ naive T-Zellen aus den PBMCs verwendet, die mit CMV-pp65-geprimten DCs geprimt wurden. Orientierend an dem Protokoll von Wölfl et al. entwickelten wir einen Versuchsaufbau bestehend aus DC-Generierung, CD45RA+-Zellselektion und Koinkubation der Zellen. Dieses 13-tägige Protokoll wurde bei 5 seronegativen Spendern durchgeführt und zeigte in der FACS Analyse CMV-spezifische T-Zellen. Der prozentuelle Anteil der VST betrug zwischen 0,33-5,70%. Somit konnte gezeigt werden, dass es möglich ist VST aus seronegativem Spenderzellen zu generieren und ermöglicht somit Patienten mit seronegativen Stammzellspendern, die an einer CMV-Reaktivierung/Infektion leiden, die Option der adoptiven Zelltherapie, trotz Nichtvorhandenseins von VST im Spenderblut.
• The positive development of adoptive cell therapy into becoming an effective and safe treatment option is extremely important for patients with opportunistic infections with e.g. CMV or EBV after undergoing a stem cell transplantation. Due to the lack of virus specific T cells (VST) in CMV-seronegative donors, it is not possible to treat the recipient with specific cells after a CMV infection, which would be possible with seropositive donors. This fact is a major problem with seropositive recipients who have received a stem cell transplant from a seronegative donor. The risk of a CMV reactivation is extremely high. This dissertation attempted to find an approach to find a solution for this problem and offer these patients a treatment option by developing an adoptive cell therapy for this specific donor/recipient constellation. The research approach behind it was to prime naive T cells of a seronegative donor with a CMV-specific antigen (CMVpp65) with the intention to develop VST. Initially unmanipulated PBMCs were incubated with CMVpp65 primed monocytes in different ratios. This simple experimental set-up did not lead to success which led to further measures which are described below. In this thesis monocytes were selected through two methods: adherence methode and selection via magnetic Microbeads. Due to the significant differenciation in monocyte purity after seperation the Microbeads were prefered to assure a better ratio between antigene presenting cells (APC) and T cells. Furthermore monocytes were developed into dentritic cells which were ko-inkubated with PBMCs. Unfortunately neither of these methods led to the desired result. In order to achieve a possible success we oriented ourselves towards the „nature protocol“ of Wölfl et al.46. Unmanipulated PBMCs were replaced by CD45RA+ naive T cells from PBMCS selected via Microbeads, which were co-incubated with CMV-pp65 primed DC. We developed a 13-day protocol which contained DC generation, CD45RA+ cell extraction and co-incubation. This protocol was implemented in five individual seronegative participants who showed CMV-specific cells in the following FACS analysis. The percentage of VST was between 0.33 – 5.70%. In conclusion, it could be shown that it is possible to generate CMV-specific T cells from seronegative material. This allows an adoptive cell therapy for patients a seronegative donor a therapeutic option after a CMV reactivation/infection despite the abscence of VST in donor blood.