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Nikolai Michal Grebenovsky

• The fact that the interaction of oligonucleotides follows strict rules has been utilized to create two- or three-dimensional objects made of DNA. With computer-assisted design of DNA sequences, any arbitrary structure on the nanometer- to micrometer-scale can be generated just by hybridization of the needed strands. As astonishing these structures are, without any modification of the DNA strands involved no function can be assigned to them. Many different ways of functionalizing DNA-nanostructures have been developed with light-responsive nanostructures having a rather subordinated role. Almost all light responsive DNA-nanostructures involve the acyclic azobenzene-linking system tAzo based on D-threoninol which is known to work best at elevated temperatures to ensure optimal switching. As the structure of DNA-constructs is mainly maintained by hydrogen-bonding, variation of the temperature should be avoided in order to keep the structure intact. To develop a light-responsive nanostructure model system with low-temperature operating azobenzene C-nucleosides, DNA-minicircles have been utilized. Those minicircles bear a lariat-like protrusion with a 10 base long single-stranded overhang, which is responsible for the dimerization with a ring bearing a complementary binding region. DNA-minicircles have been produced in a sequential manner by building and purifying the single stranded minicircle first by splint ligation and prepratative PAGE or RP-HPLC, followed by annealing it to the outer ring and subsequent purification by molecular-weight cut-off. Imaging of DNA-minicircles by atomic force microscopy (AFM) was possible with several methods of sample preparation leading to images of varying quality. With the help of AFM, qualitative analysis of the minicircles was possible. It could be shown, that theoretical and empirical size dimensions of the rings and their interactions were in great accordance. Designing the interaction site of the minicircles proved to be the main task in this project. The amount of C-nucleosidic modifications was identified by screening, followed by a screening of their optimal position and binding partners in the counterstrand. Two azobenzene C-nucleosides in a 10mer binding region and abasic sites opposing them appeared to give the best compromise between absolute dimerization ratio and photocontrolled change of it, as identified by native PAGE. In the following, the dimerization ratios of minicircles containing azobenzene C-nucleosides were compared with minicircles containing tAzo and unmodified minicircles. It could be shown, that the tAzo-modification leads to an elevated binding affinity compared to the unmodified minicircles, but the change upon irradiation is relatively humble compared to the C-nucleosides. For the C-nucleosidic modifications dimerization ratios reached a maximum of 40% in favored trans-state, but could be almost completely turned-off when switching into cis-state. In addition, arylazopyrazole-modified C-nucleosides could be switched into trans-state by irradiating at 530 nm, which is an improvement compared to standard azobenzene, as it shifts irradiation wavelength closer to the phototherapeutic window. The utilization of DNA-analogous C-nucleosides bring two drawbacks with them: the ribose units include the flexibility of the sugar conformation and it is reasonable to think, that upon isomerization of the azobenzene, part of the steric stress generated is compensated by the sugar reconfiguration, which is lost for duplex destabilization. In addition, the combination of the ribosidic linker end the end-to-end distance of trans-azobenzene causes the chromophore to penetrate deep into the base stack of the opposing strand, causing a serious destabilization even in favored trans-state. The goal was to find a linker system, that combines the benefits of the azobenzene C-nucleoside without the possibility to change sugar conformation and the strong destabilization in the trans-state. For this reason locked azobenzene C-nucleosides in analogy to LNA nucleosides have been synthesized. The synthesis of LNA analogous azobenzene C-nucleosides (LNAzo) was possible over a 16-step synthesis, with the critical step being the addition of in situ lithiated azobenzene to protected sugar aldehyde. Both anomers of LNAzo and mAzo as reference where incorporated into different oligonucleotide test systems by solid phase synthesis for thorough evaluation. It could be shown, that LNAzo β has a similar performance to mAzo in DNA with overall slightly increased TM- and ΔTM-values. Performance of LNAzo β was similar to mAzo even if steric stress is reduced by using abasic sites in the counterstrand opposing the azobenzene. Only in a RNA context, the true potential of LNAzo β could be observed. In a DNA/RNA duplex, photocontrol could be improved by almost 50%, in a RNA/RNA duplex even by over 100%. Although the primary goal was the improvement of the azobenzene C-nucleoside for a DNA-nanostructure context, LNAzo β proved not to give a sufficient improvement in regard to the cost-value ratio. Never the less, the invention of the locked azobenzene C-nucleoside was a huge success for reversible photoregulation of RNA hybridization. With this, a new way to regulate RNA hybridization has been found, which could be used to create RNA therapeutics in an antisense-approach. As LNAzo β improved duplex stability only in a limited amount in DNA, further improvements on the backbone have been declared futile and focus shifted onto optimization of the chromophore. First, the azobenzene as it is installed on the ribosidic linker decreases duplex stability by forcing its distal aromat deep into opposing base stacking region. It would be an improvement, if in favored trans-state the distal aromat would be positioned in the less confined space of either major or minor groove and only upon isomerization would shift into base pairing region. Second, the azobenzene itself is not able to contribute to attractive interactions aside from relatively weak π-interactions to adjacent nucleobases, which could be improved, if it could partake in hydrogen bonding. For those apparent reasons, 2-phenyldiazenyl-modified purines have been selected as targets. They combine the ability to contribute to hydrogen bonding of nucleobases with the photochomicity of azobenzenes. Both 2’-deoxyadenosine- and 2’-deoxyguanosine-analogue photoswitches dAAzo and dGAzo have been synthesized and incorporated into 10mer DNA test systems by solid phase synthesis. It could be shown, that duplex stability could be increased compared to established azobenzene C-nucleoside. The improvement was stronger for dAAzo than for dGAzo as in the case for guanosine the amino function on the C2-position had to be replaced by the phenyldiazenyl function, reducing its ability to form hydrogen bonds. Unfortunately, photocontrol of duplex stability caused by 2-phenyldiazenyl purines was rather limited. A reason for this could be the positioning of the distal aromat within the duplex, which can be close to the opposing nucleobase (endo-helical) or in greater distance (exo-helical). The exo-helical conformation of the trans-isomer can only switch to the exo-P-cis-conformation, which relocates the distal aromat in the minor groove, without significant impact on duplex stability.
• Die Tatsache, dass die Interaktion von Oligonukleotiden nach strengen Regeln erfolgt, wird heutzutage genutzt um zwei- oder dreidimensionale Objekte aus DNA herzustellen. Durch computergestütztes Design der Oligonukleotidsequenzen und der Fähigkeit diese durch Festphasensynthese zu realisieren, kann jede beliebige Struktur aus DNA im Nano- bis Mikrometermaßstab hergestellt werden. So beeindruckend diese Strukturen auch sein mögen, in den meisten Fällen kann ihnen keine direkte Funktion zugewiesen werden. Um diese Strukturen zu funktionalisieren, wurden viele verschiedene Modifikationen entwickelt. Die Einbringung lichtschaltbarer Modifikationen, um die Strukturen mit Licht geeigneter Wellenlänge zu manipulieren spielte dabei bisher eine eher untergeordnete Rolle. Zudem wurden lichtschaltbare DNA-Nanostrukturen bisher fast ausschließlich durch Einbau der D-Threoninol-basierten Azobenzol-Modifikation tAzo umgesetzt. Der Nachteil dieses Bausteins stellt die Notwendigkeit von erhöhten Temperaturen dar, um seinen Einfluss auf die Oligonukleotidhybridisierung optimal nutzen zu können. Da die strukturelle Integrität von DNA-Nanostrukturen aber hauptsächlich auf thermolabile Wasserstoffbrückenbildung aufbaut, ist Temperaturvariation in den meisten Fällen keine Option. Die kürzlich entwickelten Azobenzol C-Nukleoside dagegen versprechen aufgrund ihrer hohen Rigidität zur Lösung dieses Problems beizutragen, da sie nachweislich auch bei niedrigeren Temperaturen optimal nutzbar sind. Um ein lichtschaltbares DNA-Nanoarchitekturmodellsystem auf Basis von Azobenzol C-Nukleosiden zu entwickeln, wurden sogenannte DNA-Minicircles benutzt. Diese DNA-Ringe weisen sich durch einen lassoförmigen Fortsatz aus, welcher über eine einzesträngige Bindungsstelle verfügt. Sofern diese Bindungsstelle durch Azobenzol C-Nukleoside modifiziert wurde, kann die Dimerisierung der DNA-Minicircles durch Licht gesteuert werden. Die DNA-Minicircles wurden schrittweise aufgebaut. Beginnend mit dem einzelsträngigen Innenring, welcher durch Splintligation und anschließender Aufreinigung durch präparative PAGE oder RP-HPLC, konnten die DNA-Minicircles modular durch simple Hybridisierung der entsprechenden Einzelstränge mit dem Innenring aufgebaut werden. Die so hergestellten DNA-Minicircles konnten mit Hilfe von AFM-mikroskopischen Untersuchungen charakterisiert werden. Hierbei wurden verschiedene Probenpräparationstechniken genutzt, die zu unterschiedlicher Qualität der Aufnahmen führte. An Hand dieser Aufnahmen konnten theoretische Dimensionen der DNA-Minicircles und ihrer Dimere mit empirischen Daten bestätigt werden. Das Sequenzdesign der Bindungsstelle der lichtschaltbaren DNA-Minicircles stellte hierbei die Hauptaufgabe dar, welche nach einigen Iterationen als zwei Azobenzol C-Nukleosidmodifikationen in einer 10mer-Bindungssequenz mit gegenüberliegenden abasischen Modifikationen identifiziert wurde. Im Folgenden wurde der Einfluss der im Zuge dieser Arbeit synthetisierten Azobenzol C-Nukleosidmodifikationen im DNA-Minicircle-Testsystem anhand von nativer PAGE untersucht. Im direkten Vergleich mit unmodifizierten und tAzo-modifizierten DNA-Minicircles konnte gezeigt werden, dass ein Maximum der Dimerisierungsrate von 40% durch die C-Nukleoside im bevorzugten trans-Zustand erreicht werden konnte. Sofern die Azobenzolreste photochemisch in die cis-Konformation geschaltet wurden, ließ sich die Dimerisierung nahezu quantitativ unterbinden, welches den großen Vorteil dieser Modifikationen zeigt. Zudem konnten die neu entwickelten Arylazopyrazol C-Nukleoside bei Licht der Wellenlänge 530 nm betrieben werden, welches wesentlich näher am phototherapeutischen Fenster liegt als unmodifizierte Azobenzole. Im Zuge dieses Projektes sind zwei Schwächen der DNA-analogen Azobenzol C-Nukleoside aufgefallen. Zum einen führt der End-zu-End-Abstand des Azobenzols selbst im bevorzugten trans-Zustand zu erheblicher sterischer Abstoßung im gegenüberliegenden Strang, zum anderen kann durch konformationelle Änderung im nukleosidischen Linker ein Teil der Hebelwirkung der Isomerisation des Azobenzols kompensiert werden, was dessen Wirkung relativiert. Um auf beide Schwächen einzugehen, wurden Azobenzol C-Nukleoside auf Basis von konformationell-fixierten Nukleosiden (LNA) entwickelt. Dies gelang mit Hilfe einer 16-stufigen Synthese, welche als essenziellen Schritt den nukleophilen Angriff eines in situ lithiierten Azobenzols auf einen offenkettigen Zuckeraldehyden hatte. Hierbei konnten beide Anomere des sogenannten LNAzo-Bausteins synthetisiert und als entsprechhende Phosphoramidite in Oligonukleotide eingebaut werden. Im direkten Vergleich mit dem unmodifizierten Wildtyp und dem DNA-analogen Azobenzol C-Nukleosid in Schmelzkurvenstudien zeigte sich, dass der Effekt in DNA für alle Modifikationen ähnlich war, selbst wenn gegenüber der Modifikationen abasische Modifikationen eingebaut wurden. Da LNA-Bausteine bekanntermaßen den A-Helixcharakter fördern, konnte das wahre Potential der neuen Bausteine erst in einem RNA-Kontext gezeigt werden. So war die photokontrolle im DNA-RNA-Hybrid etwa 50% besser, im RNA-RNA-Duplex sogar über 100% besser, als im Referenzsystem. Trotz der Verbesserung für RNA-Systeme konnte kaum eine Verbesserung für die Anwendung in DNA-Nanostrukturen verzeichnet werden. Es wurde angenommen, dies lag daran, dass der Azobenzolrest von sich aus zu viel Störung in das System einbringt, ohne zur Stabilisierung des Duplex beizutragen. Um diesem Problem zu begegnen, wurden 2-Phenyldiazenylmodifiationen der Purinbasen Adenosin und Guanosin entwickelt, da die Fähigkeit Wasserstoffbrücken auszubilden gepaart mit der photochemisch-induzierten Änderung der Morphologie eines Azobenzols vielversprechend war. Beim einbau in DNA-Testsysteme und im direkten vergleich mit dem unmodifizierten Wildtyp und dem DNA-analogen Azobenzol C-Nukleosid stellte sich heraus, dass die Affinitiät der DNA-Stränge zueinander in der Tat gesteigert werden konnte, welches vermutlich an der Fähigkeit Wasserstoffbrücken auszubilden lag. Allerdings blieb die Photokontrolle der Hybridisierungsaffinität hinter der des Referenzsystems und somit hinter den Erwartungen. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte sein, dass die 2-Phenyldiazenylpurine in Verschiedenen Konformationen vorliegen können. Sofern der distale Aromat während des Isomerisierungsvorgangs sich nur in der kleinen Furche des Duplex bewegt, würde kein Kraftübertrag auf die Basenpaarung stattfinden und die Photoisomerisierung der photochromen Nukleobase würde kaum oder keinen Einfluss auf die Duplexstabilität haben. Diese Theorie ließ sich aber nicht experimentell bestätigen.