Open Access

Jorge Carvalho

• G protein coupled receptors (GPCRs) are the largest family of cell-surface receptors encoded in the human genome. They mediate the cellular responses to a wide variety of stimuli, ranging from light, odorants, and metabolic cues to hormones, neurotransmitters, and local mediators. Upon ligand binding, the GPCR undergoes conformational changes resulting in the activation of heterotrimeric G-proteins belonging to the families Gs, Gi/o, Gq/11, G12/13, which in turn mediate the downstream signaling. While most of the 360 non-olfactory GPCRs are well studied, approximately 120 GPCRs are still considered "orphan", meaning that their mechanism of activation and biological function is unknown. GPCRs have been functionally described in the regulation of almost all organ systems, and their dysregulation has been implicated in the pathogenesis of a multitude of diseases. In the vascular system, the contractile tone of vessels is crucially regulated by GPCRs. Substances that act through G12/13- and Gq/11-coupled GPCRs are associated with facilitation of contraction, while Gs-coupled GPCRs are usually associated with the induction of relaxation. Furthermore, while Gq/11 pathway activation promotes proliferation and dedifferentiation of vascular smooth muscle cells (VSMC), G12/13 and Gs signaling pathways promote expression of contractile proteins and differentiation. The functional properties of VSMC depend on the anatomical location, and a recent single-cell expression analysis showed that VSMC from different vascular beds have different patterns of GPCR expression. Interestingly, smooth muscle cells (SMCs) from resistance arteries not only express various GPCRs for known modulators of vascular tone, but also a number of orphan GPCRs. These results suggest a potential role of orphan GPCRs in the modulation of blood pressure. Orphan GPCR GPRC5B was one of the GPCRs enriched in resistance arteries, and this receptor was also upregulated in dedifferentiated aortal SMC. The function of GPRC5B in these types of SMC is currently unknown. In vitro studies suggested that GPRC5B negatively regulates obesity, inflammation, insulin secretion and fibrotic activity, but there are no data available with respect to its function in regulation of vascular tone or other SMC functions. Our study aimed at the identification of the specific functions of GPRC5B in SMC. To do so, we generated a SMC-specific GPRC5B-deficient mouse line by crossing Gprc5bfl/fl mice with smooth muscle-specific, tamoxifen-inducible Myh11-CreERT2 mice. We found that SMC-specific deletion of GPRC5B did neither affect myogenic tone in pressure myography, nor the response to the contractile agonists in wire myography. In contrast, vessel relaxation in response to prostacyclin analogues cicaprost and iloprost, which act on the prostacyclin receptor IP, were increased. These results suggested a selective improvement of IP receptor signaling. The IP receptor is coupled to Gs protein, it promotes vasorelaxation and acts as a restraint on platelet activation. Using overexpression of IP and GPRC5B in HEK cells, we found that GPRC5B physically interacts with the IP receptor and controls IP trafficking and membrane localization. Furthermore, we found that membrane IP receptor expression was increased in GPRC5B-deficient human aortic SMC and in resistance vessels of SMC-specific GPRC5B. To investigate the importance of increased IP-mediated signaling in SMC in vivo, we measured blood pressure in two mouse models of hypertension. We found that SMC-deletion of Gprc5b resulted in a significant reduction of blood pressure compared with control mice, which suggested that Gprc5b negatively regulated relaxation in hypertensive disease by decreasing IP mediated relaxation. In line with this notion we found that application of the IP antagonist Cay10441 largely abrogated the beneficial effect of GPRC5B inactivation in this hypertension model. Another important function of the IP receptor is the regulation of SMC differentiation, which led us to investigate the differentiation state of GPRC5B-deficient SMC. We found that deletion of GPRC5B enhanced expression of contractile genes and reduced expression of proliferative markers. This improved differentiation was, at least partially, due to increased IP signaling in SMC. Moreover, in a mouse model of atherosclerosis SMC-specific deletion of Gprc5b reduced plaque area and contributed to a more stable fibrous cap by promoting differentiation. In conclusion, deletion of GPRC5B in SMC significantly improved contractility and differentiation by increasing IP receptor membrane availability and signaling.
• G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen die größte Familie der im menschlichen Genom kodierten Zelloberflächenrezeptoren dar. Sie vermitteln die zellulären Reaktionen auf so diverse Stimuli wie Licht, Gerüche, Metaboliten, Hormone, Neurotransmittern und lokalen Mediatoren. Nach Ligandenbindung an den GPCR kommt es zu Aktivierung heterotrimerer G-Proteine der Familien Gs, Gi/o, G12/13 und Gq/11, welche dann die nachgeschalteten Signale vermitteln. Während die meisten der 360 nicht-olfaktorischen GPCRs gut erforscht worden sind, gibt es noch ungefähr 120 "verwaiste" (engl. "orphan") GPCRs für die sowohl der Aktivierungsmechanismus als auch die biologische Funktion unbekannt sind. GPCRs sind bei der Steuerung fast aller Organsysteme von Bedeutung, und ihre Dysfunktion ist mit der Pathogenese einer Vielzahl von Krankheiten in Verbindung gebracht worden. Im vaskulären System sind GPCRs unabdingbar für die Regulation des Gefäßtonus. Substanzen, die über G12/13- und Gq/11-gekoppelte GPCRs agieren, werden mit der Förderung von Kontraktionen in Verbindung gebracht, während Aktivierung Gs-gekoppelter GPCRs gewöhnlich zu Relaxierung führt. Darüber hinaus führt Aktivierung des Gq/11-Signalweges zu Proliferation und Dedifferenzierung von vaskulären glatten Muskelzellen (im Folgenden "SMCs" für "smooth muscle cells"), während die Signalwege G12/13 und Gs die Expression von kontraktilen Proteinen und die Differenzierung fördern. Die funktionalen Eigenschaften von vaskulären SMCs hängen von ihrer anatomischen Verortung ab, und eine kürzlich erfolgte Einzelzell-Expressionsanalyse zeigte, dass aus verschiedenen vaskulären Betten stammende SMCs verschiedene GPCR-Expressionsmuster aufweisen. Interessanteweise exprimieren SMCs aus Widerstandsarterien nicht nur verschiedene GPCRs für bekannte Modulatoren des vaskulären Tonus, sondern auch eine Anzahl von "orphan"-GPCRs. Diese Ergebnisse legen eine potentielle Rolle von "orphan"-GPCRs bei der Modulation des Blutdruckes nahe. GPRC5B war einer derjenigen "orphan"-GPCRs, die in Widerstandsarterien angereichert waren, und zusätzlich war dieser Rezeptor in dedifferenzierten Aorten-SMCs hochreguliert. Die Funktion von GPRC5B in diesen Arten von SMCs ist momentan noch unbekannt. Unsere Untersuchungen zielen auf eine Identifizierung der spezifischen Funktionen von GPRC5B in SMCs ab. Dafür generierten wir eine SMC-spezifische, Tamoxifen-induzierbare GPRC5B-defiziente Mauslinie, indem wir Gprc5bfl/fl-Mäuse mit Myh11-CreERT2-Mäusen kreuzten. Myographische Untersuchungen zeigten, dass die Deletion von GPRC5B in SMCs weder Einfluss auf den myogenen Tonus noch auf die Antwort auf kontraktile Agonisten hatte. Im Gegensatz dazu war die durch Prostazyklinrezeptor (IP)-Agonisten induzierte Gefäßrelaxation verstärkt, was auf eine selektive Verbesserung der IP-Rezeptor-Signalweiterleitung hindeutete. In Überexpressionsstudien in HEK-Zellen konnten wir zeigen, dass GPRC5B physisch mit dem IP-Rezeptor interagiert und dessen Lokalisierung in der Zellmembran kontrolliert. In Übereinstimmung damit fanden wir in GPRC5B-defizienten humanen Aorten-SMCs und in Widerstandsgefäßen von SMC-spezifischen GPRC5B-Knockoutmäusen eine erhöhte Verfügbarkeit von IP-Rezeptoren. Um die Bedeutung erhöhter IP-vermittelter Signalweiterleitungsaktivität in SMCs in vivo zu untersuchen, führten wir Blutdruckmessungen in zwei Mausmodellen des Bluthochdruckes durch. Wir fanden, dass die Deletion von Gprc5b in SMCs im Vergleich zu Kontrollmäusen eine signifikante Reduktion des Blutdruckes zur Folge hatte und dass die Applikation des IP-Antagonisten Cay10441 diesen günstigen Effekt weitgehend aufhob. Da der IP-Rezeptor auch dafür bekannt ist, die Dedifferenzierung von SMCs zu hemmen, untersuchten wir zusätzlich den Differenzierungszustand von GPRC5B-defizienten SMCs. Es zeigte sich, dass die Deletion von GPRC5B die Expression von kontraktilen Genen verstärkte und die Expression proliferativer Marker abschwächte. Dieser Differenzierungsphänotyp von SMCs war, zumindest teilweise, auf eine erhöhte Signalweiterleitungsaktivität von IP in SMCs zurückzuführen. Darüber hinaus reduzierte die SMC-spezifische Deletion von Gprc5b in einem Atherosklerose-Mausmodell die Ausbreitung von Plaques und trug durch seine Differenzierungs-fördernde Wirkung zu einer stabileren fibrösen Kappe bei. Aus diesen Arbeiten schlussfolgern wir, dass die Deletion von GPRC5B in SMCs über eine Steigerung der Membranverfügbarkeit des IP-Rezeptores die Kontraktionsfähigkeit und Differenzierung deutlich verbessert.