Open Access

David Malicek

• Einleitung In ihrer klinischen Symptomatik lassen sich der ischämische Schlaganfall (IS) und die intrazerebrale Blutung (ICH) nicht sicher unterscheiden. Hinsichtlich der Akuttherapie, die eine möglichst schnelle Wiederherstellung der zerebralen Sauerstoffversorgung („time is brain“) zum Ziel hat, ist diese Differenzierung jedoch essentiell. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist der Nachweis serologischer Biomarker in der Frühphase des Schlaganfalls zur Differenzierung zwischen IS und ICH. Hypothesen-gestützt wurden aufgrund pathophysiologischer Überlegungen hierfür die ZNS-spezifischen Proteine GFAP, UCH-L1, pNf-H, MBP und Tau untersucht. In einem hypothesenfreien Ansatz wurden Serumproben von Schlaganfallpatienten massenspektrometrisch analysiert. Material und Methoden Die Patientenrekrutierung für die vorliegende Arbeit erfolgte im Rahmen der prospektiven, multizentrischen BE FAST II-Studie zur Evaluation von GFAP als Biomarker der akuten ICH. Von Mai 2012 bis April 2014 wurden Serumproben von Patienten mit akuter Schlaganfallsymptomatik in der Klinik für Neurologie der Goethe-Universität Frankfurt am Main gesammelt. Mittels kommerziell verfügbaren ELISA-Kits wurden die Serumkonzentrationen der Proteine UCH-L1, pNf-H, MBP und Tau bestimmt. Die Analyse der GFAP-Serumkonzentration erfolgte durch Roche Diagnostics mit Hilfe des Elecsys®-Systems, einem Elektrochemiluminiszenz-Immunoassay. Für die Massenspektrometrie wurden Serumproben aus der BE FAST-I-Studie, die von Ende des Jahres 2010 bis Anfang des Jahres 2011 asserviert wurden, eingesetzt. Die massenspektrometrischen Untersuchungen wurden in der Abteilung „Funktionelle Proteomics“ im Fachbereich Medizin der Goethe-Universität Frankfurt am Main durchgeführt. Ergebnisse Tau und MBP ließen sich in den meisten Serumproben nicht nachweisen. In der pNf-H-Messung lag die Konzentration bei 27 von 35 Patienten oberhalb der Nachweisgrenze, wobei sich kein signifikanter Unterschied zwischen IS und ICH ergab (p = 0,69). UCH-L1 ließ sich bei 28 von 29 Patienten nachweisen. In der IS-Gruppe war eine signifikant (p = 0,005) höhere UCH-L1-Konzentration nachweisbar (Median 5,71 ng/ml) als in der ICH-Gruppe (Median 2,37 ng/ml). GFAP war bei allen 45 Patienten nachweisbar mit signifikant (p < 0,00005) höherer Konzentration in der ICH-Gruppe (Median 2,87 ng/ml) verglichen mit der IS-Gruppe (Median 0,01 ng/ml). Zudem fand sich eine positive Korrelation der UCH-L1-Werte in der IS-Gruppe mit dem Patientenalter (r = 0,62, p = 0,01), sowie eine positive Korrelation der GFAP-Werte in der ICH-Gruppe mit dem Patientenalter (r = 0,54, p = 0,03), dem NIHSS-Wert (r = 0,69, p = 0,04) und mit dem ICB-Volumen (r = 0,60, p = 0,01). In der massenspektrometrischen Analyse ließ sich eine Top Liste aus 22 Proteinen erstellen, die jeweils signifikante Unterschiede zwischen IS und ICH aufweisen. Diskussion Die Rolle des Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) und insbesondere von UCH-L1 beim IS ist bislang noch nicht abschließend geklärt. Nach einer zerebralen Ischämie ist jedoch eine Upregulation von UCH-L1 beschrieben, u.a. durch eine verstärkte UPS-Aktivität durch Aggregate fehlgefalteter Proteine. Daneben reagieren Neurone sensibler auf eine Hypoxie als Gliazellen mit einer dominierenden Freisetzung neuronaler Proteine wie UCH-L1. Bei ICH kommt es dagegen eher zu einer unspezifischen Destruktion des Hirngewebes mit vorwiegender glialer Schädigung und rascher Freisetzung glialer Proteine wie GFAP. Mit UCH-L1 und GFAP konnten zwei Proteine als erfolgsversprechende Kandidaten zur Differenzierung zwischen IS und ICH in der Frühphase identifiziert werden. Zur weiteren Validierung sind Untersuchungen an einer großen Population notwendig, die auch kleinere Infarkte und Hirnblutungen einschließt. Auch der Einfluss epidemiologischer und klinischer Faktoren wie z.B. dem Patientenalter muss weiter evaluiert werden. Die mittels Massenspektrometrie erstellte Top Liste aus 22 Proteinen enthält vielversprechende Biomarker-Kandidaten, die signifikante Unterschiede zwischen IS und ICH aufweisen und ebenso an einem großen Patientenkollektiv weiter untersucht werden müssen.
• Introduction Ischemic stroke (IS) and intracerebral hemorrhage (ICH) cannot be reliably distinguished based on their clinical presentation only. With regard to acute therapy, which aims at fast restoration of the cerebral oxygen supply ("time is brain"), this differentiation is essential. The aim of this work is the detection of serological biomarkers in the early phase of stroke for differentiation between IS and ICH. For pathophysiological reasons CNS-specific proteins GFAP, UCH-L1, pNf-H, MBP and Tau were chosen. In a hypothesis-free approach, serum samples from stroke patients were analyzed by mass spectrometry. Materials and methods The patient recruitment for this work occured within the prospective, multicentric BE FAST II study on the evaluation of GFAP as a biomarker of acute ICH. From May 2012 to April 2014 serum samples from patients with acute stroke symptoms were collected in the Department of Neurology at the Goethe University Frankfurt am Main. The serum concentrations of UCH-L1, pNf-H, MBP and tau were determined by commercially available ELISA kits. Analysis of GFAP serum concentration was performed by Roche Diagnostics using the Elecsys® system, an electrochemiluminescence immunoassay. For mass spectrometry, serum samples from the BE FAST-I study, which were conserved from the end of 2010 until the beginning of 2011, were used. Mass spectrometry have been performed in the Functional proteomics group in the Faculty of Medicine of the Goethe University Frankfurt am Main. Results Tau and MBP were undetectable in most serum samples. In the pNf-H measurement, the concentration in 27 of 35 patients was above the detection limit, with no significant difference between IS and ICH (p = 0.69). UCH-L1 was detected in 28 out of 29 patients. In the IS group a significant (p = 0.005) higher UCH-L1 concentration was detectable (median 5.71 ng/ml) than in the ICH group (median 2.37 ng/ml). GFAP was detectable in all 45 patients with significant (p <0.00005) higher concentration in the ICH group (median 2.87 ng/ml) compared to the IS group (median 0.01 ng/ml). In addition, a positive correlation of the UCH-L1 values were found in the IS group with the patient age (r = 0.62, p = 0.01) and also a positive correlation of the GFAP values in the ICH group with the patient age (r = 0.54, p = 0.03), the NIHSS value (r = 0.69, p = 0.04) and the ICB volume (r = 0.60, p = 0.01). In the mass spectrometric analysis, a top list of 22 proteins with significant differences between IS and ICH was created. Discussion The role of the ubiquitin-proteasome system (UPS) and in particular of UCH-L1 in IS has not been clarified yet. However, after cerebral ischemia, upregulation of UCH-L1 has been described by increased UPS activity by aggregates of misfolded proteins. In addition, neurons are more sensitive to hypoxia than glial cells with a dominant release of neuronal proteins such as UCH-L1. In ICH, however, nonspecific destruction of the brain tissue with predominant glial damage and rapid release of glial proteins such as GFAP occurs. With UCH-L1 and GFAP, two proteins could be identified as promising candidates for differentiation between IS and ICH in the early phase. Further validation requires studies on a large population that also includes minor infarcts and cerebral hemorrhage. Also the influence of epidemiological and clinical factors such as e.g. the patient's age must be further evaluated. The mass spectrometry top list of 22 proteins contains promising biomarker candidates that show significant differences between IS and ICH and need further study on a large patient population.