Open Access

Linda Melzer

• Astrozyten erfüllen verschiedene Funktionen im Zentralnervensystem, welche sich in die Bereiche Entwicklung, Durchblutung, Metabolismus, Strukturerhalt und Gliotransmission unterteilen lassen. Astrozyten sind an der synaptischen Informationsverarbeitung beteiligt und wirken an zahlreichen höheren Hirnfunktionen mit. Durch Regulation der synaptischen Transmission und Plastizität sind Astrozyten am Lernverhalten und Erinnerungsvermögen, sowie an der Verhaltensmodulation und Verarbeitung emotionaler Reize involviert. Im Zuge dieser zahlreichen Funktionen können Astrozyten auf externe Stimuli mit der gezielten Freisetzung von Gliotransmittern reagieren. In kultivierten Astrozyten konnte Keil143 das TGN, bestehend aus Zisternen und Vesikeln, darstellen und mit anti-Rab6 identifizieren. Rab6 mit seinen Subtypen A und B gehört der Superfamilie der monomeren Ras-GTPasen an, die den intrazellulären Membran- und Vesikelverkehr regulieren. Rab6 spielt in HeLa-Zellen beim Transport vesikulärer Organellen vom TGN zur Zellmembran eine wichtige Rolle. Assoziationsanalysen von Rab6A mit vesikulären Glutamattransportern, Serinracemase und Markern der regulierten Exozytose in kultivierten Astrozyten143 deuten darauf hin, dass dieses Rab6A-Organellsystem die ultrastrukturelle Grundlage für die Freisetzung von Gliotransmittern wie D-Serin und Glutamat bildet. Zur Untersuchung, ob Rab6A tatsächlich ein System der Glia-Neuron-Kommunikation im Gehirn darstellt, war es zunächst unabdingbar das Vorkommen von Rab6A in situ zu untersuchen. Die durchgeführten immunzytochemischen Färbungen an Hirnschnitten der Maus zeigen das gleichmäßige und ubiquitäre Vorkommen von Rab6A in allen untersuchten Hirnregionen. Durch verblindet durchgeführte Kolokalisationsanalysen von Rab6A mit den etablierten astrozytären Markern Glutaminsynthetase (GS), Glial fibrillary acidic protein (GFAP), Aldh1L1 und Sox9 konnte eine Lokalisation von Rab6A in allen Astrozyten gezeigt werden. Weitere Analysen schließen die Lokalisation von Rab6A in Mikroglia (Iba1), NG2-Zellen (NG2) und Oligodendrozyten (CNPase) aus. Die Astrozyten unterscheiden sich in Größe und subzellulärem Verteilungsmuster der Rab6A+ Strukturen, wonach eine Kategorisierung in vier Typen vorgenommen wurde. Anhand der Einteilung kann vermutet werden, dass größere Rab6A+ TGN-Zisternen bis weit in die Zellperipherie transportiert werden und kleine Rab6A+ Vesikel erst dort ausknospen und der Exozytose zugeführt werden. Zur Frage der möglichen astrozytären Subpopulationen konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Astrozyten GS+, Aldh1L1+, Sox9+ und Rab6A+ sind, jedoch nicht GFAP+. Um die prinzipielle Übertragbarkeit der gewonnenen Befunde auf den Menschen zu überprüfen, wurde reseziertes Cortex-Gewebe von drei Patienten mit unterschiedlicher pathologischer Genese untersucht. Rab6A ist im massiven Ausmaß in humanen Astrozyten lokalisiert, was nahelegt, dass die zuvor an der Maus gewonnenen Ergebnisse auf den Menschen übertragbar sind. Die mögliche funktionelle Bedeutung von astrozytärem Rab6A im Gehirn wurde an HFS-Schnitten untersucht. Die Untersuchung zeigt einen signifikanten Anstieg der Rab6A+ Intensität in der gesamten Molekularschicht der Fascia dentata der stimulierten im Vergleich zur unstimulierten Seite. Da die HFS ein etabliertes LTP-Modell darstellt, könnte es infolge dieser zu einer strukturellen, intrazellulären Veränderung der Astrozyten mit erhöhter Freisetzung von D-Serin oder Glutamat aus Rab6A+ Vesikeln kommen, was das Lernverhalten beeinflussen könnte. Die dargestellten Ergebnisse legen eine Auswirkung der HFS auf Rab6A nahe. Zur Bestätigung der immunzytochemischen Untersuchungen wurde die mRNA-Expression von Rab6A in Astrozyten bereits publizierter Transkriptomanalysen untersucht. Die in den Publikationen verwendeten Genom-Chips treffen allenfalls indirekt eine Aussage zu Rab6A, da Rab6 allgemein und nur Rab6B spezifisch untersucht wurde, jedoch keine spezifische Rab6A Sonde erwähnt wird. Zusammenfassend kann Rab6A als spezifisches und selektiv in Astrozyten vorkommendes Protein dargestellt und als neuer astrozytärer Marker etabliert werden, der auch Astrozyten des humanen Gewebes markiert. Durch die gewonnenen Befunde kann in nachfolgenden Studien die mögliche Bedeutung von Rab6A in neuropathologischen und neurophysiologischen Prozessen untersucht werden.
• Astrocytes fulfil various functions in the central nervous system, which can be divided into the areas of development, blood circulation, metabolism, structure maintenance and gliotransmission. Astrocytes are involved in synaptic information processing and participate in numerous higher brain functions. By regulating synaptic transmission and plasticity, astrocytes are involved in learning behavior and memory, as well as behavioral modulation and processing of emotional impulses. In the course of these numerous functions, astrocytes can react to external stimuli with the targeted release of gliotransmitters. In cultured astrocytes, Keil143 was able to represent the TGN, consisting of cisterns and vesicles, and identify it with anti-Rab6. Rab6 with its subtypes A and B belongs to the superfamily of monomeric Ras-GTPases, which regulate intracellular membrane and vesicle traffic. In HeLa cells, Rab6 plays an important role in the transport of vesicular organelles from the TGN to the cell membrane. Association analyses of Rab6A with vesicular glutamate transporters, serine racemase and markers of regulated exocytosis in cultured astrocytes143 suggest that this Rab6A organelle system forms the ultrastructural basis for the release of gliotransmitters such as D-serine and glutamate. In order to investigate whether Rab6A actually represents a system of glia-neuron communication in the brain, it was first essential to investigate the presence of Rab6A in situ. The immunocytochemical staining of mouse brain slices performed as part of this study showed the uniform and ubiquitous presence of Rab6A in all investigated brain regions. A blinded colocalization analysis of Rab6A with the established astrocytic markers glutamine synthetase (GS), glial fibrillary acidic protein (GFAP), Aldh1L1, and Sox9 showed a localization of Rab6A in all astrocytes. Further analyses of Rab6A with markers of other glial cell types exclude the localization of Rab6A in microglia (Iba1), NG2 cells (NG2) and oligodendrocytes (CNPase). Furthermore, the astrocytes differ in size and subcellular distribution pattern of the Rab6A+ structures, according to which they were categorized into four types. Based on the classification it can be assumed that larger Rab6A+ TGN cisterns are transported far into the cell periphery and that small Rab6A+ vesicles are budded out there and are introduced into exocytosis. Regarding the question of possible astrocytic subpopulations, it could be shown that all examined astrocytes are GS+, Aldh1L1+, Sox9+ and Rab6A+, but not GFAP+. In order to examine the principle transferability of the findings to humans, resected cortex tissue of three patients with different pathological genesis was examined within the framework of epilepsy surgery. Rab6A is massively localized in human astrocytes, suggesting that the results obtained in mice are transferable to humans. Radiofrequency stimulation, an established LTP model, could lead to structural intracellular changes in astrocytes with increased release of D-serine or glutamate from Rab6A+ vesicles, leading to a positive effect on learning behavior. The study shows a significant increase in Rab6A+ intensity in the entire molecular layer of the fascia dentata of the stimulated side compared to the unstimulated side, suggesting an influence of stimulation on the release of Rab6A+ vesicles. To confirm the immunocytochemical investigations, the mRNA expression of Rab6A in astrocytes of already published transcriptome analyses was investigated. The genome chips used in the publications make at most an indirect statement about Rab6A, since Rab6 was examined in general and Rab6B only specifically, but no specific Rab6A probe is mentioned. In summary, Rab6A can be presented as a specific protein selectively present in all astrocytes and established as a new astrocytic marker localized in human astrocytes. Based on these findings, the possible role of Rab6A in neuropathological and neurophysiological processes can be investigated in subsequent studies.