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Johannes Wolfgang Kovar

• Aufgrund der starken Heterogenität und Komplexität der akuten myeloischen Leukämie ist diese bis heute nicht zufriedenstellend zu behandeln. Die bestmögliche Therapie wird mittlerweile zunehmend auf die Erkrankung des Einzelnen angepasst. Vermehrt gewinnen Tyrosinkinase-Inhibitoren in der Therapie an Bedeutung. Diese Inhibitoren hemmen Proteine auf zellulärer Ebene. Bei etwa 30% der AML-Patienten lassen sich Mutationen des FLT3-Gens nachweisen. Das Gen kodiert für die fms like tyrosine kinase 3, eine Rezeptor-Tyrosinkinase an der Zelloberfläche von unreifen Blutzellen des Knochenmarks. Durch Mutationen des FLT3 Gens erhalten diese Zellen einen Proliferationsvorteil gegenüber den physiologischen Blutzellen. Am häufigsten kommt es zu in frame-Insertionen des FLT3-Gens, vor allem im Bereich der juxtamembranen Domäne: sogenannte interne Tandemduplikationen (ITD). Weiterhin kommen zu einem geringeren Teil Punktmutationen einzelner Codons, zum Beispiel im Bereich des activation loops oder im Bereich des gatekeepers vor. Durch das Auftreten der Punktmutationen, die entweder bereits zum Zeitpunkt der Diagnose vorliegen oder erst während einer Therapie mit einem Tyrosinkinase-Inhibitor entstehen können, verändert sich das Bindungsverhalten vieler solcher gegen FLT3 gerichteten Inhibitoren. Durch Letzteres kann ein mögliches Therapieversagen beispielsweise während der Behandlung mit AC220 (Quizartinib) erklärt werden (Smith et al.). In der vorliegenden Dissertationsschrift sind Unterschiede der Signalwege zwischen FLT3-ITD und FLT3-ITD mit der zusätzlichen gatekeeper-Punktmutation F691L herausgearbeitet. Dafür wurden die beiden FLT3-Mutationen in den Vektor pMy-IRES-GFP eingebracht und retroviral in Ba/F3-Zellen transduziert. Nach Überprüfung der Expression von FLT3 ITD und dem Wachstumsverhalten unter Zugabe von AC220 (Quizartinib), wurden verschiedene Signalkaskaden von FLT3 mittels Western Blot untersucht. Hierbei zeigten sich sowohl Unterschiede für die Expression von phosphoryliertem ERK als auch von phosphoryliertem STAT5. Durch verschieden starke Expressionen der FLT3130kDa- und FLT3160kDA-Varianten wurde eine unterschiedliche Lokalisation von FLT3-ITD in Zellen mit und ohne die Mutation F691L postuliert. Allerdings ließ sich diese experimentell mittels Immunfluoreszenz nicht belegen, da die Methode für die verwendeten Suspensionszellen nicht ausreichend geeignet war. In den durchgeführten Versuchen zum Wachstumsverhalten der Zellen bei der Verwendung von Kinaseinhibitoren konnte bei der Verwendung des SYK-Inhibitors R406 eine dosisabhängige Proliferationshemmung der FLT3-ITD-mutierten Ba/F3- und 32D-Zellen beobachtet werden. Die Hemmung von FLT3 durch R406 wurde in der Literatur bereits beschrieben (Braselmann et al.). Die abschließenden Experimente der Massenspektrometrie mit SILAC Markierung lassen mit der Detektion von mehreren hundert signifikant regulierten phosphorylierten Proteinen in den beiden FLT3-ITD-exprimierenden Populationen auf die Aktivierung unterschiedlicher Signalwege schließen. Durch das Vergleichen einzelner Teilexperimente ergaben sich Proteine, deren Phosphorylierung mehrfach in die gleiche Richtung reguliert war. Für Zellen, die zusätzlich zur ITD-Mutation die Mutation F691L besaßen, konnten insgesamt sieben hoch-regulierte, phosphorylierte Proteine ermittelt werden, bei denen ein zellulärer Effekt durch die Phosphorylierung der entsprechenden Aminosäurereste in der Literatur beschrieben ist. Das im Western Blot nachgewiesene, in Zellen mit der Mutation F691L stärker phosphorylierte STAT5 ist aller Voraussicht nach Ursache der nachgewiesenen verstärkten Phosphorylierung von RPS6 im Experiment der globalen Phosphorylierung. Die PIM-Kinasen als Substrate einer STAT5-induzierten Transkription phosphorylieren RPS6 an Serin 235. Dies führt seinerseits zu einer verstärkten Translation von mRNA weiterer Gene. Die genauen Zusammenhänge der hier ermittelten Unterschiede müssen jedoch weiter untersucht werden. In Zukunft könnte zudem die Untersuchung der beiden Proteine SHP 1 oder HSP90 weitere Aufschlüsse über die unterschiedlichen Signalwege geben. Für beide Proteine wurden Phosphorylierungen detektiert, die in den untersuchten Zellen mit FLT3-ITD bzw. der zusätzlichen Punktmutation F691L unterschiedlich reguliert sind.
• Acute myeloid leukemia is characterized by a distinct heterogeneity and complexity. Therefore, no coherent satisfying treatment exists. Recently, the respective therapy is mainly adjusted to the individual patient and tyrosine kinase inhibitors (TKI) become more important. These inhibitors block specific proteins on a cellular level. About 30% of all adult AML patients exhibit mutations of the FLT3-gene. The gene encodes the fms like tyrosine kinase 3, a cell surface receptor tyrosine kinase of immature blood cells in the bone marrow. Through mutations of the FLT3 gene, these cells gain an advantage in proliferation compared to physiologic blood cells. The most common mutations of the FLT3 gene are in-frame insertions, mostly located in the part that encodes the juxtamembrane domain. Those mutations are known as internal tandem duplications (ITD). To a lesser extent, there are point mutations of several codons e.g., in the area of the activation loop or localized at the gatekeeper. These point mutations change the binding capacity of FTL3 targeting TKIs and are present at the time of AML diagnosis or can develop during treatment with TKIs. As a consequence, the respective cells may not respond to treatment with e.g. AC220 (Quizartinib) anymore resulting in a therapeutic failure (Smith et al.). The objective of this work was to investigate the signaling pathways of FLT3-ITD and FLT3 ITD plus the additional gatekeeper point mutation F691L describing similarities and differences. Therefore, these two mutations were introduced into the vector pMy IRES GFP and retroviral transduced into murine Ba/F3 cells. Subsequently, the expression was checked for FLT3 and the proliferation of the transduced cells during treatment with AC220 was observed. Afterwards, several signaling pathways were analyzed by Western blotting. In these experiments, differences in expression of phosphorylated ERK and phosphorylated STAT5 could be shown for the mutations of interest. An observed difference in expression of FLT3130kDa and FLT3160kDa variants led to the conclusion of varying FLT3-ITD localizations depending on the additional point mutation F691L. However, this hypothesis could not be verified by the performed immunofluorescence experiments since this method was not suitable for the used suspension cells. In the proliferation assay, the SYK inhibitor R406 has shown to be a potent inhibitor of FLT3 ITD mutated BA/F3 and 32D cells whereas, proliferations of FLT3- wildtype cells could only be inhibited at much higher R406 concentrations. This is in contrast to Braselmann, who showed previously an inhibitory effect for R406 on FLT3. (Braselmann et al.). The concluding mass spectrometry experiments with SILAC-labeled cells showed several hundred significantly regulated phosphorylated proteins in both FLT3-ITD expressing populations implying an activation of different signaling pathways. By comparing parts of these experiments, several proteins could be identified whose changes in phosphorylation went multiple times into the same direction. For the population with both mutations (FLT3-ITD and F691L) seven upregulated, phosphorylated proteins have been detected for which a phosphorylation of the specific amino acid residue has been described in the literature already. In Western blots, STAT5 was more phosphorylated when cells expressed FLT3 carrying the F691L in addition to the ITD mutation. This could explain why RPS6 was detected to be stronger phosphorylated in the global phosphorylation experiment. PIM kinases as target proteins of a STAT5 induced transcription can phosphorylate serine 235 of RPS6 resulting in an enhanced transcription of mRNA. The exact impact has to be examined in future experiments. The two proteins SHP-1 and HSP90 represent further targets for a better understanding of the differently activated pathways. Differential phosphorylation of both proteins has been detected in FLT3-ITD and in FLT3-ITD plus the TKD mutation F691L expressing cells.