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Kerstin Hiesinger

• Entzündungen sind eine Gegenreaktion des Körpers auf einen schädlichen Stimulus. Eine akute Entzündung zeichnet sich durch typische Zeichen wie Schwellung, Rötung, Überwärmung, Schmerz und eingeschränkter Funktionsfähigkeit aus.Findet die Auflösung der Entzündung nur sehr langsam oder nicht statt, entsteht eine chronische Entzündung. Eine chronische Entzündung kann Auslöser vieler schwerwiegender Krankheiten, wie Diabetes mellitus, Krebs oder kardiovaskulärer Erkrankungen sein. Die symptomatische Behandlung einer chronischen Entzündung erfolgt unter anderem durch NSAIDs. Diese haben bei einer Langzeiteinnahme schwere Nebenwirkungen wie gastrointestinale Blutungen oder nephrotoxische Eigenschaften.NSAIDs greifen in den Metabolismus der Arachidonsäure-Kaskade ein. Die Arachidonsäure wird über mehrere Enzyme metabolisiert, die drei Hauptmetabolismuswege erfolgen über die Cyclooxygenase- (COX), 5-Lipoxygenase- (5-LOX) und Cytochrom P450-Enzyme (CYP450). Studien ergaben, dass die Inhibition eines Metabolismusweges eine Verschiebung der Lipidwerte innerhalb des Arachidonsäurestoffwechsels verursacht. Viele dieser Nebenwirkungen bei einer Langzeitmedikation kommen vermutlich durch die Verschiebung der Metabolite zustande.8 Diese Problematik könnte möglicherweise durch eine Inhibition mehrerer Metabolismuswege umgangen werden. Tierstudien belegen eine bessere Wirksamkeit dualer Inhibitoren gegenüber der Einzelverabreichung von „selektiven“ Inhibitoren und zudem wird ein erhöhtes Sicherheitsprofil für duale Inhibitoren postuliert.9,10 Im Rahmen dieser Arbeit wurden einerseits duale Inhibitoren der löslichen Epoxidhydrolase (sEH) und Leukotrien-A4-Hydrolase (LTA4H) und anderseits der sEH und der 5-Lipoxygenase entworfen, synthetisiert und in vitro gegenüber den betreffenden Enzymen in einem Aktivitätsassay evaluiert. Es ist gelungen, duale Inhibitoren der sEH und LTA4H mit IC50-Wert im submikromolaren Bereich zu synthetisieren. Dies wurde durch die Erweiterung des Fragments 3-(4-(Benzyloxy)phenyl)propan-1-ol, welches Amano et al. publizierten, bewerkstelligt.11 Die synthetisierten Inhibitoren wurden analytisch charakterisiert und in vitro auf ihr inhibitorisches Potential untersucht. Des Weiteren konnte die Kristallstruktur eines dualen Inhibitors in der Bindetasche der sEH gelöst werden und damit weitere Erkenntnisse über den Bindungsmodus des Inhibitors gewonnen werden. Es konnten auch duale Inhibitoren der sEH und 5-LOX synthetisiert werden und jene auf ihr inhibitorisches Potential untersucht werden. Es wurden einige Inhibitoren mit submikromolaren bis nanomolaren IC50-Werten gegenüber beiden Zielproteinen entworfen, synthetisiert und analytisch charakterisiert. Da mehrere Inhibitoren zwei stereogene Zentren aufweisen, wurde ein Inhibitor mit definierten Stereozentren durch eine asymmetrische Synthese generiert. Ein stereogenes Zentrum wurde über drei Schritte synthetisiert und zum Nachweis der Reinheit des Enantiomeres zum Diastereomer gekuppelt. Per NMR-Spektroskopie wurde das Verhältnis (dr 9:1) der Diastereomere zueinander bestimmt. Das andere stereogene Zentrum wurde mit Hilfe eines Evans-Auxiliar über eine achtstufige Synthese dargestellt und mit dem Enantiomer aus der dreistufigen Synthese verknüpft. Per HPLC konnte ein dr-Verhältnis von 99:1 für den Inhibitor HK330 bestimmt werden. Das andere Diastereomer wurde mittels HPLC aus dem Recemat isoliert. Eine in vitro Evaluation zeigte, dass der Einfluss des stereogenen Zentrums auf das Inhibitionsvermögen marginal ist. Nach einer Evaluation des Inhibitionsvermögens, der Löslichkeit, der Zelltoxizität, der metabolischen Stabilität und der synthetischen Zugänglichkeit, wurde der Inhibitor HK330 weiter untersucht. In einem Zellassay konnte jener die 5-LOX-Aktivität senken, die 12- und 15-LOX wurde jedoch nicht inhibiert. Des Weiteren wurde der Inhibitor in einer pharmakokinetischen Studie untersucht und erreichte Plasmawerte, die bis zu 4 h in der aktiven Konzentration des Inhibitors lagen. LC-MS/MS Untersuchungen der Plasmaproben ergaben ein erhöhtes EETs/DHETs-Verhältnis, welches die in vivo Inhibition der sEH bestätigt. Die Verbindung HK330 besitzt vielversprechende Eigenschaften und deshalb soll die Wirksamkeit des Inhibitors in einem Tiermodell getestet werden. Geeignete Tiermodelle wie die unilaterale Harnleiterobstruktion (unilateral ureteral obstruction, UUO) in Mäusen könnten Aufschlüsse über die Wirksamkeit von HK330 geben. Denn sowohl die Inhibition der 5-LOX als auch der sEH sind renoprotektiv.12,13 Die profibrinolytischen und anti-inflammatorischen Eigenschaften eines sEH-Inhibitors könnten auch in einem Tiermodell zur gestörten Wundheilung untersucht werden. In einem murinen Ohrwundmodell wurde gezeigt, dass eine Behandlung mit Epoxyeicosatriensäuren (EETs) die Wundheilung signifikant beschleunigte.15 Ramalho et al. zeigten, dass die Leukotriene des 5-LOX-Metabolisimusweges eine verminderte Wundheilung in diabetischen Mäusen (Typ 1) bewirkten.
• Inflammation is a physiological response of the body against harmful stimuli. An acute inflammation shows typical signs such as redness, pain, swelling, disability of organ functions and is actively resolved. Delay or failure of the resolution leads to a chronic inflammatory state. Chronic inflammation may cause the development of several diseases like diabetes mellitus, cancer or cardiovascular diseases.2 NSAIDs are worldwide in use for the symptomatic treatment of inflammation. However, chronic use of NSAIDs causes serious side effects such as gastrointestinal bleeding and nephrotoxicity. NSAIDs interfere with the metabolism of arachidonic acid (AA), a polyunsaturated omega-6 fatty acid. AA is metabolized via enzymatic cascades, out of which the three major pathways are the Cyclooxygenase (COX), 5-Lipoxygenase (5-LOX) and the Cytochrom P450 (CYP450) branch. Recent studies showed that a crosstalk between these pathways and an inhibition of a single pathway causes a shunting towards another branch of the AA cascade. The shunting effects could be responsible for several side effects in long term NSAIDs use. This circumstance could be avoided by simultaneous inhibition of more than one pathway of the AA cascade. Animal studies demonstrated a higher efficiency of dual inhibitors in comparison to administration of an inhibitor targeting a single pathway. Furthermore, an improved safety profile for dual inhibitors is postulated.9 Regarding these results, the aim of this work is the design and synthesis of dual inhibitors which interfere with the 5-LOX and CYP450 branches of the AA cascade. Two combinations were explored, dual inhibitors of the soluble epoxide hydrolase (sEH) and leukotriene A4 hydrolase (LTA4H), as well as the sEH and 5-Lipoxygenase (5-LOX). The synthesized inhibitors were evaluated in in vitro activity assays to determine their inhibitory potential. In this work the synthesized dual inhibitors of sEH and LTA4H were analytically characterized and evaluated in in vitro activity assays. This was realized by the use and elongation of a published fragment 3-(4-(benzyloxy)phenyl)propan-1-ol from Amano et al.11 Consequently, dual inhibitors of sEH and LTA4H were obtained and the best ones exhibit submicromolar IC50 values regarding both enzymes. The sEH was crystallized and the structure with the synthesized dual inhibitor in the binding pocket of the sEH could be solved. The co-crystal structure revealed further information about the binding mode of the inhibitor. The approach of the synthesis of dual inhibitors of the sEH and 5-LOX and the analytical characterization was accomplished as well. Several dual inhibitors with submicromolar IC50 values could be synthesized. Regarding the sEH even nanomolar IC50 values could be achieved during the optimization process. During this process inhibitors with two stereocenters were synthesized. To investigate the influence of the stereochemistry, asymmetric syntheses were performed. One stereocenter was isolated over a three-step synthesis and the purity of the enantiomere was proofed via derivatization to a diastereomer. NMR spectroscopy revealed a diastereomeric ratio of 9:1. The second stereocenter was synthesized over an eight-step synthesis with the help of an Evans auxiliary. The combination of both asymmetric fragments yielded one compound with a diastereomeric ratio of 99:1, determined via HPLC. The other diastereomer was isolated from the racemate via HPLC. In vitro activity assay results indicated that the influence of the second stereocenter is only of minor impact. The evaluation of the inhibitory potency, solubility, toxicity, metabolic stability and synthetic accessibility resulted in the choice of compound HK330 for further assays. Compound HK330 inhibited 5-LOX in a cell assay without inhibition of 12- and 15-LOX. In addition, HK330 was evaluated in a pharmacokinetic study in mice and yielded plasma levels in effective concentrations for 5-LOX and sEH inhibition over approximately 4 h. LC-MS/MS analysis of the plasma revealed an increased EETs/DHETs ratio, confirming the inhibition of the sEH. To determine the efficacy of HK330 in vivo animal models were required, in which the sEH and the 5-LOX are crucial. Savina et al. observed in diabetic db/db mice that a local inhibition of the sEH improved microcirculatory function in mice skin.17 This might prevent the development of skin complications, which typically occur in diabetic patients. Another study to observe the effects of the inhibitor could be performed in models of chronic kidney diseases. Inhibitors of sEH and 5-LOX exhibit renoprotective properties. Kim et al. demonstrated in mouse kidneys after unilateral ureteral obstruction, that an sEH inhibitor promoted anti-inflammatory and fibroprotective effects.14 An additional study confirmed that inhibition of the 5-LOX pathway reduced renal fibrosis in an UUO mouse model.18 In conclusion, a dual sEH/5-LOX inhibitor should have superior properties in this model.