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Luis Alfredo Patiño Miranda

• Grundlagen: Das Neuroblastom ist der häufigste extrakranielle solide Tumor im Kindesalter. Die Patienten in der Hochrisikogruppe haben trotz der Weiterentwicklung der Therapie immer noch eine sehr schlechte Prognose. Die Entwicklung von Resistenzen und die darauffolgende Progression der Erkrankung sind kennzeichnende Phänomene innerhalb dieser Patientengruppe. Die hier vorgestellte Charakterisierung von MYCN amplifizierten, Cisplatin adaptierten chemoresistenten Neuroblastomsublinien UKF-NB-3rCDDP1000 I bis XII ist eine grundlegende Aufgabe, um den Phänotyp des multiresistenten/ Hochrisiko Neuroblastoms besser zu verstehen. Des Weiteren könnte diese Charakterisierung zu einem besseren Verständnis der Rolle von Krebsstammzellen beim Neuroblastom führen. Methoden: Die Empfindlichkeit zu verschiedenen Zytostatika wurde im Viabilitätsassay untersucht. Die Expression mehrerer Stammzellmarker wurde durch Durchflusszytometrie überprüft. Im Western Blot wurde die Expression der Proteine p53, p21, XIAP und Survivin untersucht. Die Proliferation der verschiedenen Sublinien wurde durch den Kolonienbildungstest untersucht. Ergebnise: In dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass die Cisplatin adaptierten Sublinien zusätzliche Resistenzen gegenüber weiteren klassischen Zytostatika zeigen. Abgesehen von der erworbenen Cisplatin-Resistenz zeigen die Cisplatinsublinien erhöhte IC50-Werte für die Wirkstoffe YM-155, Doxorubicin, Melphalan, Vincristin, Docetaxel, Etoposid, Carboplatin und Vinblastin (jeweils im Vergleich zu UKF-NB-3). Von den getesteten klassischen Zytostatika hat nur Gemcitabin bei den Cisplatin adaptierten Sublinien eine gute Wirksamkeit. In dieser Arbeit konnte die Expression von mehreren Stammzellmarkern, sowohl bei den Cisplatin resistenten Sublinien als auch bei der parentalen Zelle UKFNB-3, nachgewiesen werden. Durch die Cisplatinadaptierung ergaben sich Unterschiede in der Expression von CD-133, Nanog, Nestin, Sox-2 und GD2. Im Kolonienbildungstest konnten keine großen Unterschiede festgestellt werden, die Cisplatin-adaptierten Sublinien zeigen tendenziell eine geringere Kolonienbildung als UKF-NB-3. Konklusion: Der Nachweis von unterschiedlichen Stammzellmarkern bei den Neuroblastomsublinien UKF-NB-3rCDDP1000 I bis XII ist ein wichtiger Hinweis für die Existenz von Zellen mit Stammzellfähigkeiten innerhalb der Sublinien. Durch ein besseres Verständnis der biologischen Merkmale in resistenten Neuroblastomzellen könnten neuartige gezielte Therapiestrategien entdeckt werden. Viele der bei dieser Arbeit untersuchten Moleküle vermögen einen Effekt bei der Entstehung von Resistenzen und bei Aufrechterhaltung der Proliferation und Überleben von Neuroblastomzellen sowie Neuroblastomkrebsstammzellen zu haben. Folglich könnten diese Zielmoleküle (CD-133, Nanog, Nestin, Sox-2 und GD2) in der Zukunft benutzt werden, um neue therapeutische Strategien zu entwickeln, die sowohl die multiresistenten Neuroblastomzellen als auch die Neuroblastom-krebsstammzellen besser abtöten können. Zusätzlich ist Gemcitabin als Medikament nach Cisplatintherapie klinisch interessant.
• Background: Neuroblastoma is the most frequent occurring solid tumor outside of the brain in infants. Despite the progress in therapy, high risk patients still have a very poor prognosis. The development of chemoresistance and the subsequent progression of the disease are common phenomenons within this group of patients. The characterisation of the MYCN amplified and cisplatin adapted chemoresistant Neuroblastoma sublines UKF-NB-3rCDDP1000 I to XII is a fundamental task, with the aim of a better understanding of the multiresistent / High risk Neuroblastoma phenotype. Furthermore, this characterisation could lead to a better understanding of the role of neuroblastoma cancer stem cells. Methods: The sensitivity to different cytotoxic drugs was determined by viability assay. Expression analysis of several stem cell markers was performed by flow cytometry. Verification of the expression levels of p53, p21, XIAP and Survivin was carried out by Western blot. The proliferation rate of the different sublines was examined by colony forming assay. Results: This thesis shows that the cisplatin adapted sublines exhibit additional resistance to other classic cytotoxic drugs. Apart from the acquired resistance against cisplatin, the sublines exhibit higher IC50 values for the cytotoxic drugs YM-155, doxorubicin, melphalan, vincristine, docetaxel, etoposide, carboplatin and vinblastine (compared to UKF-NB-3). It appears that from all of the tested drugs, gemcitabine is the one to have a good effectiveness on the cisplatin adapted sublines. This thesis was able to detect expression of several stem cell markers, both in the cisplatin resistant sublines as well as in the chemosensitive Neuroblastoma cell line UKF-NB-3. The cisplatin adaptation process resulted in differences in the expression of CD-133, Nanog, Nestin, Sox-2 and GD2. In the colony formation test, no great differences were found but the cisplatin-adapted sublines tend to show less colonization than UKF-NB-3. Conclusion: The detection of different stem cell markers in the cisplatin adapted neuroblastoma sublines UKF-NB-3rCDDP1000 I to XII is an important clue for the existence of cells with stem cell capacities within the sublines. With a better understanding of the biological features in cisplatin resistant neuroblastoma cells, new targeted therapie strategies could be discovered. Many of the molecules studied in this work may play a role in the formation of resistance and in the maintenance of proliferation and survival of the neuroblastoma cells as well as neuroblastoma cancer stem cells. Thus, these molecules (CD-133, Nanog, Nestin, Sox-2 and GD2) could be used in the future to develop new therapeutic strategies that can better target both the multiresistant neuroblastoma cells and the neuroblastoma cancer stem cells. Furthermore, Gemcitabin is still effective in all cisplatin adapted Sublines and could therefore be very interesting for the clinic.