Open Access

Tabea Sabine Thomas

• In der Akuten Lymphatischen Leukämie (ALL) im Erwachsenenalter beträgt die 5–Jahres-Überlebensrate trotz verbesserter Therapien unter 40%. Die Prognose wird durch das Auftreten von Rezidiven signifikant verschlechtert. ALL entsteht durch genetische Veränderungen lymphatischer Vorläuferzellen im Knochenmark, welche zu einem Differenzierungsblock und zu starker Zunahme der Vorläufer-zellen führen. Eine mögliche Erklärung für das bestehende hohe Rezidiv-Risiko wird in der unvollständigen Elimination von Leukämie-induzierenden Zellen (LIZ) durch die Primärtherapie gesehen. Die Identifizierung und Charakterisierung von LIZ in der ALL anhand spezifischer Oberflächenmarker war bisher nicht möglich, daher ist die molekulare und funktionelle Charakterisierung von LIZ für die Entwicklung moderner Therapieansätze unabdingbar. Metabolische Analysen primärer ALL-Langzeitkulturen (LZK) in Vorarbeiten zeigten eine deutliche Abweichung des Kohlenhydratstoffwechsels vom physiologischen metabolischen Profil einer Knochenmarkszelle hin zur Nutzung der Glykolyse mit zunehmendem leukämogenen Potential der etablierten LZK. Folglich ist in dieser Dissertation der Zusammenhang zwischen höherer Glukoseaffinität, schnellerer Glukoseaufnahme und dem Vorliegen eines höheren leukämogenen Potentials der Zellen und damit einer Definition der LIZ anhand ihres Energiestoffwechsels untersucht worden. Hierfür wurden Tests im Mausmodell in vivo und in vitro mit drei ALL-LZK CR, PH und BV durchgeführt. Wir etablierten unter Verwendung des fluoreszenzmarkierten Glukoseanalogons 2–NBDG sowie eines gegen den GLUT–1 gerichteten Antikör-pers jeweils ein durchflusszytometrisches Verfahren zur quantitativen Messung der Glukoseaufnahme. Anhand dieser Parameter erfolgte die FACS-Anreicherung unterschiedlicher Zellpopulationen der LZK und die Xenotransplantation zur Evaluation potentieller Unterschiede des leukämogenen Potentials. Durch durchflusszytometrische Messungen konnten in den drei LZK jeweils drei Subpopulationen von Zellen anhand ihrer Glukoseaffinität unterschieden werden (2–NBDG negativ, 2–NBDG positiv und 2–NBDG hochaffin). Auch zeigten sich Unterschiede in der Kinetik der Glukoseaufnahme der drei getesteten LZK, wobei CR Zellen mit Abstand am schnellsten 2–NBDG aufnahmen, gefolgt von PH. Die schnellere Glukoseaufnahme der LZK CR und PH wurde durch eine vermehrte Expression des GLUT-1 Rezeptors und einen höheren Anteil an GLUT–1 positiver Zellen hervorgerufen. Interessanterweise bestand auch eine Korrelation zwischen höherem leukämogenem Potential mit schnellerer Glukoseaufnahme und stärkerer GLUT–1 Expression. Hierbei zeigte sich, dass die HIF-1α Stabilisierung unter Normoxie in einer vermehrten GLUT–1 Expression und daraufhin vermehrter Glukoseaufnahme resultierte. Die prospektive Anreicherung von distinkten Zellsubpopulationen der LZK CR und PH aufgrund ihrer Glukoseaufnahme (gemessen durch 2–NBDG) und Transplantation der sortierten Zellpopulationen in NSG Empfängermäuse zeigte keine kohärente Beziehung zwischen der Glukoseaffinität der Zellen und der Entwicklung der Leukämie. Während es bei CR Zellen initial zu einer beschleunigten Expansion der 2–NBDG-positiv sortierten Leukämiezellen kommt, was sich aber nicht signifikant auf das Gesamtüberleben der Empfängermäuse auswirkt, zeigte die serielle Transplantation von 2–NBDG negativen Zellen ein schnelleres Ableben der Tiere. Bei der LZK PH expandierten 2–NBDG-negative Zellen schneller in primären Empfängermäusen als positive Zellen. Dabei konnten zelltoxische Effekte durch die Verwendung von 2–NBDG ausgeschlossen werden. Auch die Transplantation von GLUT-1 positiven bzw. negativen CR Zellen zeigte, dass GLUT-1 negative Zellen schneller in den Mäusen expandierten, eine aggressivere Leukämie verursachten und zu einem früheren Ableben der Mäuse führte. Diese Ergebnisse zeigen keine unmittelbare Korrelation von Glukoseaufnahme oder GLUT-1 Expression und der Leukämogenität der untersuchten ALL Zellen. Daher können diese Eigenschaften nicht dazu verwendet werden LIZ in ALL prospektiv anzureichern. Im Rahmen dieser Dissertation zeigte sich aber auch, dass sich die LZK in ihrer jeweiligen Gesamtpopulation bezüglich ihres Glukoseaufnahmeverhaltens und ihrem Anteil GLUT-1-positiver Zellen unterschieden. Weiterführende Untersuchungen sind nötig, um den Grund der differentiellen Expression von GLUT-1 und der damit zusammenhängenden gesteigerten Glukoseaufnahme einzelner Zellen in der ALL zu ermitteln.
• In face of improved therapies the 5-year survival rate of acute lymphatic leukaemia in adulthood constitutes fewer than 40% and the prognosis is downgraded significant by relapses. The disease originates from malignant gene mutations in lymphatic precursor cells which leads to a block in differentiation and an increase of precursor cell numbers. One potential explanation for the high rate of relapse is the incomplete elimination of leukaemia-inducing cells (LIC) by standard therapies. Until now it is not possible to identify and characterize LIC in ALL on the basis of specific surface marker expression, hence, functional and molecular characterization of LIC is indispensable for the development of advanced therapies. Metabolic analyses of patient-derived long-term cultures (PDLTCs) in the research group showed differences in carbohydrate metabolism in comparison to the metabolic profile of physiological bone marrow cells. Therefore, this dissertation analyses the association between higher glucose affinity, faster glucose uptake and higher leukemic potential of the cells, trying to define LICs by their carbohydrate metabolism. We performed xenotransplantation experiments in vivo and in vitro assays with three ALL-PDLTCs CR, PH and BV. First, we established FACS analyses by using an antibody against GLUT-1 and the fluorescent glucose analogue 2 – NBDG to measure glucose-uptake quantitatively. Thereby we enriched diverse populations in the PDLTCs by FACS and used them in a xenotransplantation to evaluate functional differences of their leukemic potential. We separated three subpopulations in the PDLTCs (2 – NBDG negative, 2 – NBDG positive and 2 – NBDG high affine) according to their glucose affinity via FACS. In addition we detected differences in the kinetics of glucose uptake between the three PDLTCs in which CR cells showed the fastest uptake, followed by PH. This faster uptake was provoked by higher expression of GLUT-1 receptors and higher percentage of GLUT-1 positive cells. Interestingly, we detected an association between higher leukemic potential, faster glucose uptake and higher GLUT-1 expression. The stabilization of HIF-1α under normoxic conditions resulted in higher GLUT-1 expression and accordingly faster glucose uptake. The prospective enrichment of distinct subpopulations of CR und PH along their glucose uptake (measured by 2 – NBDG) and transplantation of sorted subpopulations in NSG-mice did not show a coherent relationship between glucose affinity of the cells and the development of leukaemia in mice. In the first round of transplantations, the 2 – NBDG positive sorted CR cells engrafted faster, which did not influence the overall survival of the mice significantly. In contrast, the serial transplantation showed shorter lifespans in mice which were transplanted with 2 – NBDG negative sorted cells. In the PH transplantation, the 2 – NBDG negative sorted cells engrafted faster than the positive ones. In all transplantation experiments we could exclude toxic effects by 2 – NBDG. The transplantation of GLUT-1 positive and negative CR cells showed a faster engraftment of GLUT-1 negative cells in mice. They initiated a more aggressive leukaemia which resulted in a shorter span of life. Our results do not show a direct correlation between glucose uptake or GLUT -1 expression and leukaemic potential of the investigated ALL-PDLTCs. Therefore it seems unlikely to utilize these features to enrich for LIC in ALL. We revealed a considerable heterogeneity of leukaemia cells within PDLTCs regarding their glucose uptake and their proportion of GLUT-1 positive cells. Future analyses are warranted to decipher the the reason of differential GLUT – 1 expression and the resulting higher glucose uptake of single leukaemic cells in ALL.