Open Access

Patrick Ulrich Janetzko

• Einflüsse epigenetischer Mechanismen auf die Gefäßtonusregulation sind bisher kaum untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Bedeutung bekannter epigenetischer Modifikatoren in der Gefäßtonuskontrolle aufzuzeigen und molekulare Mechanismen zu identifizieren. Hierzu wurden Vasoreaktivitätsstudien an Mausgefäßen im Organbad durchgeführt und molekularbiologische Methoden eingesetzt. Verwendet wurde ein Mausstamm mit induzierbarem Knockout der Histondemethylase JARID1B (KDM5B) sowie verschiedene Inhibitoren von Histonmethylasen und -demethylasen. Mittlerweile sind eine Vielzahl an Inhibitoren epigenetischer Modifikatoren kommerziell erhältlich. Getestet wurde u.a. der Wirkstoff GSK343, welcher spezifisch die Funktion der H3K27me3-Methyltransferase Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) inhibiert. Bekannt ist eine Beteiligung von EZH2 in der Carcinogenese und Zellzykluskontrolle. Unter basalen Bedingungen sowie deutlich verstärkt nach mehrstündiger Inkubation mit murinem Lipopolysaccharid (mLPS) zeigte sich eine verzögerte Phenylephrin-induzierte Kontraktion von Präparaten der murinen Aorta thoracica. Da unter inflammatorischen Bedingungen die induzierbare NO-Synthase iNOS stark induziert wird, wurde die Hypothese formuliert, dass eine höhere Bioverfügbarkeit von NO ursächlich für diese Beobachtung ist. NO ist ein potenter Vasodilator und wird im Gefäßendothel produziert. Organbadversuche mit Inhibitoren der iNOS und eNOS konnten jedoch keine Differenzen in der NO-Bioverfügbarkeit zeigen, weder vor noch nach Stimulation mit mLPS. Über schrittweise Depolarisation durch K+-Ionen konnte eine Beeinträchtigung des kontraktilen Apparats der glatten Gefäßmuskelzellen ausgeschlossen werden. Auch die Thromboxan-induzierte Kontraktion, ausgelöst durch das Thromboxan-Analogon U46619, war nicht beeinflusst. Inhibition von EZH2 unter inflammatorischen Bedingungen, wie beispielsweise in der Sepsis, scheint einer Gefäßdysfunktion vorzubeugen. Dies geschieht unabhängig von der NO-Bioverfügbarkeit und ohne Beeinträchtigung der Kontraktilität der glatten Gefäßmuskelzellen sowie der Thromboxan-induzierten Gefäßkontraktion. Es ergibt sich die Hypothese, dass EZH2 nicht in die eigentliche Gefäßtonuskontrolle, sondern in der Transduktion inflammatorischer Signale involviert ist und damit in der Entstehung einer Gefäßdysfunktion. Diese Annahme sollte weiter untersucht werden, da sich durch Inhibition von EZH2 eine mögliche Therapieoption in der Sepsis bietet. Neuste Publikationen bestätigen eine Rolle von EZH2 in der inflammatorischen Signalkaskade. Die H3K4me3-Histondemethylase JARID1B wird in Gefäßendothelzellen stark exprimiert, bekannt sind eine Rolle in der Embryogenese, Cancerogenese sowie Angiogenese. Die Arteria mesenterica superior der Tamoxifen-induzierbaren globalen Jarid1b-Knockout Maus zeigte eine verstärkte Acetylcholin-induzierte Vasorelaxation. Diese Beobachtung konnte durch Behandlung von Wildtyp- Arterienpräparaten mit dem JARID1B-Inhibitor 2‐4(4‐methylphenyl)‐1,2‐Benziso-thiazol‐3(2H)‐on (PBIT) reproduziert werden. Ein spezifischer Knockout von Jarid1b in Makrophagen zeigte keinen vergleichbaren Phänotyp. Untersucht wurde auch hier die Hypothese, dass Veränderungen der NO-Bioverfügbarkeit Ursache des beobachteten Phänotyps sind. Unterschiede in der NO-Bioverfügbarkeit, der Expression oder des Aktivierungsgrades der eNOS konnten in Versuchen mit Inhibitoren der Synthasen sowie mittels Proteinisolation nicht festgestellt werden. Neben NO wirken Metabolite der Arachidonsäure als Vasorelaxantien. Die Inkubation mit Arachidonsäure im Organbad ergab zunächst keine Unterschiede im Relaxationsverhalten zwischen Knockout- und Wildtypgefäßen. Zur weiteren Untersuchung der Hypothese veränderter Prostanoid-Signalwege sind weitere Studien notwendig. Nach Abschluss der Arbeit konnte gezeigt werden, dass der JARID1B-Knockout die lösliche Epoxid-Hydroxylase (sEH) destabilisiert und damit über verminderten Abbau von Epoxyeicosatriensäuren (EETs) relaxierend und unter Angiotensin II-Einfluss gefäßprotektiv wirkt. Modifikationen der epigenetischen Regulation in Gefäßzellen wirken sich auf die Gefäßtonusregulation aus. Die Experimente in dieser Arbeit zeigen, dass dies abseits der häufigsten vasoaktiven Autacoid-Signalwege und unter bestimmten Voraussetzungen stattfinden kann. Epigenetische Regulation ermöglicht es, die Gefäßtonuskontrolle den Umgebungsbedingungen anzupassen und spielt in der Pathophysiologie von Gefäßerkrankungen eine entscheidende Rolle.
• The role of epigenetic mechanisms in the control of the vessel tone are incompletely understood. The aim of this study was to unravel the relevance of known epigenetic modifiers in the regulation of vessel tone and to reveal underlying molecular mechanisms. Therefore, vessel reactivity studies were performed in an organ bath setting. A mouse strain harboring an inducible knockout of histone-demethylase JARID1B (KDM5a) and different inhibitors of histone-methylases and demethylases were used. Today, a variety of inhibitors of epigenetic modifying enzymes are commercially available. In this study, the agent GSK343, which specifically inhibits the function of the epigenetic repressor and H3K27me3-methyltransferase Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2), was used. EZH2 is known to play a role in carcinogenesis as well as cell cycle control. Preparations of the murine thoracic aorta incubated with GSK343 showed a delayed phenylephrine-induced contraction. This effect was strongly increased after incubation with murine lipopolysaccharide (mLPS). Since inducible NO synthase (iNOS) is upregulated in inflammatory conditions it was proposed that an increased bioavailability of nitric oxide (NO) is responsible for the delayed contraction. NO is a potent vasodilator and is produced in the vascular endothelium. Nevertheless, organ bath studies with inhibitors of endothelial NO synthase (eNOS) and iNOS showed no differences for the bioavailability of NO, both before and after mLPS stimulation. Impairment of the contractile apparatus within vascular smooth muscle cells was excluded by induction of vascular contraction with low concentrations of potassium ions. Also, thromboxane-induced contraction caused by the thromboxane analogue U46619 was not affected. Inhibition of EZH2 under inflammatory conditions, like in sepsis, seemed to prevent vessel dysfunction. This was independent from NO bioavailability and not caused by impairment of contractile apparatus. Also, thromboxane-induced contraction was not affected. It can be hypothesized that EZH2 might not directly interfere with the control of vessel tone but is rather involved in inflammatory signaling which causes vessel dysfunction. This hypothesis should be further investigated, as inhibition of EZH2 might prove valuable in therapy of sepsis and septic shock. Current publications prove an involvement of EZH2 in the inflammatory signaling cascade. The H3K4me3-histondemethylase JARID1B is strongly expressed in human umbilical vein endothelial cells. It is known for its role in embryogenesis, angiogenesis, and carcinogenesis. Preparations of superior mesenteric arteries from tamoxifen-inducible JARID1B-knockout mice showed an increased acetylcholine-induced relaxation. This was reproduced by treatment with JARID1B-inhibitor PBIT. Specific knockout in endothelial cells and macrophages did not show this phenotype. Again, it was hypothesized that altered bioavailability of NO causes this finding. However, differences in NO-bioavailability, eNOS activation or expression level between knockout- and wildtype-preparations could not be found using inhibitors of NO-synthases in organ bath as well as on protein level. Besides NO, metabolites of arachidonic acid act as vasorelaxant autacoids. A first approach of incubating both knockout- and wildtype mesenteric artery in organ-bath did not show differences in relaxation between the two groups. Further experiments should be performed to support the hypothesis of an influence of JARID1B-knockout on prostanoid metabolism. After finishing this experimental study, JARID1B-knockout was proven to destabilize soluble epoxide hydrolase (sEH), resulting in higher bioavailability of vasorelaxant Epoxyeicosatrienoic acids (EETs) and therefore has a vasoprotective function under challenge with Angiotensin II. Modifications of epigenetic mechanisms in the vasculature appear to have direct effects on the control of vessel tone. The results of this experimental study indicate that this is different to the common vasoactive autacoid signaling pathways and exists under certain preconditions. Epigenetic regulation enables the vasculature to adapt to specific conditions and plays a decisive role in pathophysiology of vessel diseases.