Open Access

Alexandra Lucaciu

• Beim ischämischen Schlaganfall finden weitreichende systemische immunmodulatorische Anpassungsvorgänge statt. Da Sphingosin-1-Phosphat (S1P)-Signalwege für die Immunzellrekrutierung von hoher Relevanz sind, war angesichts der bekannten immunologischen Veränderungen nach zerebraler Ischämie das Ziel dieser Dissertation die genauen Veränderungen dieses Signalweges zu charakterisieren. Für diese Charakterisierung wurde ein transientes Fadenokklusionsmodell der A. cerebri media an der Maus verwendet. Die Sphingolipidkonzentrationen wurden drei oder 24 Stunden nach Okklusion in der Milz, im Plasma sowie im Hirngewebe gemessen. Parallel hierzu wurde die Immunzellrekrutierung in die von der Ischämie betroffenen Hemisphäre analysiert. Zunächst konnte diese Dissertation zeigen, dass in der Akutphase des Schlaganfalls ein S1P-Konzentrationsgradient vorherrscht. Die Milz zeigt hier die niedrigsten Konzentrationen, gefolgt von Plasma und Gehirn. Darüber hinaus besteht auch in der betroffenen Hemisphäre ein S1P-Gradient mit hohen Konzentrationen im Infarktkern, jedoch verminderten Konzentrationen im Periinfarktkortex (PIC). Zweitens führt eine fokale zerebrale Ischämie zu einer Infiltration von T- und B-Lymphozyten in die ischämische Hemisphäre. Im Gegensatz hierzu kommt es zu einer Schlaganfall-induzierten Lymphopenie im Blut. Hierzu passend konnte ich eine signifikante Abnahme des Gewichts und der B- und T-Lymphozyten der Milz 24 Stunden nach Ischämie nachweisen. Weitere von Immunzellen produzierte Zytokine (IL-6) sowie deren Transkriptionsfaktoren (SPI1, STAT3, FoxP3) zeigten in der Akutphase nach Ischämie ebenfalls eine deutliche Reduktion und wiesen auf die Rekrutierung peripherer Immunzellen (pIZ) aus dem sekundären lymphatischen Organ hin. Folgerichtig waren Leukozyten im Plasma sowohl drei als auch 24 Stunden nach Ischämie signifikant vermehrt, welche insbesondere neutrophilen Granulozyten entsprachen. Basierend auf der nachgewiesenen Reduktion von T-Helferzellen sowie regulatorischer T-Zellen sowohl in der Milz als auch in der Zirkulation, wurde drittens die Hypothese einer zerebralen Rekrutierung dieser T-Zellpopulationen gemäß dem vorliegenden S1P-Gradienten untersucht. Dabei gelang die Darstellung einer signifikanten Infiltration von CD45+-Zellen in beide Hemisphären, welche insbesondere von T-Helferzellen geprägt war. Viertens nimmt die S1P-Rezeptor (S1PR)-Expression auf Leukozyten eine bedeutende Stellung in der pIZ-Rekrutierung ein. In diesem Sinne konnte ich zeigen, dass nach zerebraler Ischämie S1P1 signifikant in der Milz vermindert exprimiert wurde. Dieses Ergebnis deutete auf einen Austritt S1P1+ Immunzellen aus der Milz dem etablierten S1P-Gradienten folgend hin. In der ischämischen Hemisphäre hingegen ließ sich ebenfalls eine Herunterregulation der exprimierten mRNA für S1P1 nachweisen, wohingegen S1P2 und S1P3 vermehrt transkribiert wurden. Dieses Ergebnis könnte Folge der mikroglialen Aktivierung sein, die bekanntermaßen mit einer Hochregulation von S1P2 und S1P3 einhergeht. Abschließend habe ich die Rolle von weiteren Sphingolipiden, u.a. von Ceramiden, untersucht, die einen signifikanten Anstieg in der Milz 24 Stunden nach Ischämie zeigten. Im Gegensatz dazu konnte ich im Gehirn keine Unterschiede der untersuchten Ceramidspezies abgrenzen, sodass in dem hier verwendeten Modell eine Beteiligung an lokalen pathophysiologischen Vorgängen eher unwahrscheinlich erscheint. Zusammenfassend beschreiben die in dieser Dissertation dargestellten Ergebnisse lokale und systemische Veränderungen des S1P-Signalwegs nach zerebraler Ischämie. Konkordante Veränderungen des Immunsystems deuten auf eine relevante Rolle veränderter S1P-Konzentrationen hin. Weitergehende, funktionelle Untersuchungen der hier beobachteten Ergebnisse müssen die potentielle therapeutische Relevanz für Patienten mit zerebraler Ischämie aufklären.
• Ischemic stroke exerts extensive systemic adaptive immunomodulatory responses. S1P-signaling pathways play an important role in immune cell recruitment and given the known immune response alterations following stroke, the aim of this dissertation was to provide a detailed characterization of the S1P signaling pathway. For this characterization, a transient filament occlusion model of the mouse middle cerebral artery was implemented. Sphingolipid concentrations were measured three or 24 hours after occlusion in spleen, plasma and brain tissue. In parallel, immune cell recruitment was analysed in the hemisphere affected by ischemia. First of all, this thesis could demonstrate a steep S1P gradient in the acute phase of stroke. The spleen showed the lowest S1P concentrations, followed by plasma and brain. In addition, there was a significant S1P increase in the ischemic hemisphere, whereas the peri-infarct cortex (PIC) showed decreased S1P levels. Secondly, focal cerebral ischemia induces an inflammatory cascade which is denoted by an early infiltration of T and B lymphocytes. This phenomenon was reflected systemically leading to a stroke-induced lymphopenia in the circulation. In accordance with this result, I could demonstrate a significant weight reduction of the spleen and a decrease of B and T lymphocytes in the spleen 24 h after ischemia. Other cytokines produced by immune cells (IL-6) as well as their transcription factors (SPI1, STAT3, FoxP3) showed a significant reduction in the acute phase after ischemia and underlined the recruitment of peripheral immune cells (pIZ) from the secondary lymphoid organ. Consequently, especially neutrophil granulocytes in plasma were increased three hours and 24 hours after ischemia. Thirdly, based on the reduction of T helper cells and regulatory T cells in both spleen and circulation, the hypothesis of cerebral recruitment of these T-cell populations in response to the S1P gradient was investigated. A significant infiltration of CD45+ cells in both hemispheres was revealed, which was particularly characterized by T helper cells. Fourthly, the S1P receptor (S1PR) expression on leukocytes plays a pivotal role in pIZ recruitment. In this sense, I could demonstrate a significant decrease of S1P1 in the spleen. This result suggested an egress of S1P1+ immune cells from the spleen in response to the S1P gradient. In the ischemic hemisphere however, S1P1 mRNA displayed a downregulation, whereas S1P2 and S1P3 showed a significant upregulation. This result might represent sequelae of microglial activation, which is accompanied by an upregulation of S1P2 and S1P3. Finally, I examined the role of further sphingolipids, i.e., ceramides, which showed a significant increase in the spleen 24 hours after ischemia. In contrast, I could not delineate differences in the brain between the analysed ceramide species, suggesting that a contribution of ceramides to pIZ recruitment is less probable in this model. In conclusion, the results of this thesis describe a local and systemic involvement of the S1P signaling pathway in immune cell migration after cerebral ischemia. Concordant immune response alterations suggest a relevant role of the changes in sphingolipid concentrations. Further insights into the herein described observations may behold the potential to pave the way to new therapeutic avenues for patients suffering from ischemic stroke.