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Ulrike Pfohl

• Despite all advancements in cancer research and clinical practice, cancer remains a life- threatening disease with an increasing incidence. According to a 2018 WHO forecast, cancer incidence will double to approximately 37 million new cancer cases by 2040. Today, clinical management of cancer is based on a "one-fits-all" strategy. Most cancers are still treated by surgical therapy followed by adjuvant or neoadjuvant chemotherapy based on rather strict guidelines (S3 guidelines in Europe) which are based on studies of large cohorts of patients with the same tumor entity. While this approach has led to substantial increases in progression-free survival and overall patient survival, most patients do not benefit from the administered treatment regimen. One reason for this is intra-tumor heterogeneity, which results from clonal evolution between cancer cells and their environment. This means that cancer patients may respond differently to a particular drug due to the different mutation patterns of their tumor cells. Therefore, patients should be screened in advance for reliable cancer biomarkers that definitively predict whether they will respond to a particular therapy. This would increase the probability of a successful treatment. Colorectal cancer (CRC) is the third most diagnosed cancer and the second leading cause of cancer deaths worldwide. The main cause of death in CRC is a metastatic disease, which is presented in 20 % of patients and eventually develops in more than 30 % of early-stage patients. Despite the significant increase (to more than 30 months) in median survival with the development of cytotoxic agents and the introduction of targeted therapy, the progression-free survival in the first-line setting has remained largely unchanged over the past decade. The heterogeneity in CRC is characterized by alterations in multiple signaling pathways that affect cellular functions such as cell proliferation or apoptosis. Commonly affected signaling pathways include the mitogen-activated protein kinase (MAPK)- and the transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein (TGF-β/BMP)-pathway. Alterations in the TGF-β/BMP pathway, due to mutations in the SMAD4 gene (mothers against decapentaplegic homolog 4), are associated with different drug response and promote resistance to chemotherapy. In addition, they are associated with a higher recurrence rate. SMAD4 is one of the most common cancer driver genes, and mutations occur in up to 15 % of CRC cases. Therefore, there is an urgent need for therapeutic agents that can specifically target SMAD4-mutated tumors. The aim of the present study was the identification of the clinical relevance of the SMAD4 gene and the investigation of its suitability as a potential biomarker in CRC. For this purpose, I investigated sibling patient-derived organoids (PDOs) derived from different regions of a chemo-naïve CRC tumor. PDOs are 3D cell cultures that reliably recapitulate the architecture of the tissue of origin, as well as preserve the genomic background and intra-tumor heterogeneity. The sibling PDOs (R1R361H and R4wt) shared the most common CRC mutations, such as KRASG12D (kirsten rat sarcoma), PIK3CAH1047R (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit alpha), and TP53C242F (tumor protein 53), but differed in a SMAD4R361H mutation and showed a different drug response. The single nucleotide variant R361H of the SMAD4 gene is among the most common pathogenic alterations in various cancers, including CRC. The sibling PDOs showed significant differences in response to the MEK-inhibitors cobimetinib, trametinib, and selumetinib. MEK-inhibitors are antineoplastic agents that inhibit the function of MEK1 and MEK2, preventing phosphorylation of transcription factors, which leads to inhibition of tumor cell proliferation. MEK-inhibitors are approved for the treatment of malignant melanoma. Currently, they are in phase-III clinical trials for the treatment of patients with metastatic CRC. To investigate whether SMAD4R361H is responsible for sensitivity to MEK-inhibitors, Iestablished three syngeneic PDOs harboring a SMAD4R361H mutation using the CRISPR/Cas9 genome editing system. All CRISPR-PDOs were significantly more sensitive to the MEK-inhibitors, compared to R4wt. I have shown that the SMAD4R361H mutation is responsible for sensitivity to MEK inhibition in CRC models and may be a predictive biomarker. To test this hypothesis, I examined 62 CRC PDO models and treated them with the MEK-inhibitors cobimetinib, trametinib, and selumetinib. All models that had a pathogenic mutation or deletion in the SMAD4 gene (15 %) were sensitive to cobimetinib, 10 % of models were sensitive to trametinib, and 8 % were sensitive to selumetinib. I performed transcriptome (RNA sequencing) and proteome analyses using the DigiWest® method to investigate the mechanism underlying MEK-inhibitor sensitivity. DigiWest® is a Luminex® bead-based analysis that allows the simultaneous analysis of over 100 (phospho-)proteins. The transcriptome and proteome data support the observation that MEK inhibition primarily affects SMAD4R361H PDOs. Furthermore, I have shown that activation of the BMP signaling pathway in organoids with wild-type SMAD4 appears to be responsible for resistance to MEK-inhibitors. Thus, a genetic alteration in the BMP signaling pathway, beyond SMAD4, could lead to sensitivity to MEK-inhibitors. I identified four genes involved in the TGF-β/BMP signaling pathway that are frequently mutated in CRC and grouped them into the so-called SFAB-signature (SMAD4, FBXW7 (F-box/WD repeat-containing protein 7), ARID1A (AT-rich interactive domain-containing protein 1A), or BMPR2 (Bone morphogenetic protein receptor type II). Clinical data show that approximately 36 % of CRC patients have at least one pathogenic mutation in these genes. I tested all 62 CRC PDO models and found a significant positive prediction for sensitivity to cobimetinib (95 %) and selumetinib (70 %) for the SFAB-signature. Trametinib and the newly approved MEK-inhibitor binimetinib showed a similar trend. Therefore, the SFAB-signature has high predictive power for response to MEK-inhibitors and could be used as a predictive biomarker panel. The current clinically used biomarkers for CRC are based on the mutation status of driver genes KRAS and BRAF, which are present in up to 50 % and 10 % of CRC, respectively. Investigation of molecular alterations in CRC revealed that mutations in the KRAS gene, which is downstream of EGFR (epidermal growth factor receptor) in the MAPK-pathway, interfere with an anti-EGFR-antibody therapy (e.g., cetuximab). Therefore, cetuximab is only relevant for RAS wild-type tumors. However, approximately 40 % of patients with RAS wild-type status do not respond to this treatment. About 53 % of CRC PDO models carry a pathogenic RAS mutation, about 10 % harbor a pathogenic BRAF mutation. Both, the RAS and RAF status alone as well as the combination of RAS and RAF status with SFAB-signature did not provide a better prediction of sensitivity to MEK inhibition.
• Eine Therapie gegen Krebs sollte für Patienten immer so spezifisch und zielgerichtet sein wie möglich. Deshalb ist die Identifizierung von prädiktiven Biomarkern wichtiger denn je. Biomarker liefern Informationen für die Risikostratifizierung von Patienten und für die Wahl der besten Behandlungsoptionen. Das kolorektale Karzinom (engl. colorectal cancer = CRC) ist eine heterogene Krankheit, die durch Veränderungen in mehreren molekularen Signalwegen gekennzeichnet ist. Es wurde bereits gezeigt, dass Veränderungen im TGF β/BMP -Signalweg z.B. durch Mutationen im SMAD4-Gen im CRC nicht nur mit einem unterschiedlichen Ansprechen auf EGFR und MEK -Inhibitoren verbunden ist, sondern auch Resistenzen gegenüber Chemotherapie fördert und mit einer höheren Rezidivrate in Verbindung steht. SMAD4 -Mutationen kommen bis zu 15 % im CRC vor. Daher besteht ein dringender Bedarf an therapeutischen Wirkstoffen, die spezifisch auf SMAD4-mutierte Tumore abzielen können. Die Hauptziele meiner Doktorarbeit waren die Identifizierung potenzieller Biomarker für eine bessere CRC-Behandlung und die Untersuchung der klinischen Relevanz des SMAD4-Gens beim CRC. Hierfür habe ich Geschwister-3D-Zellkulturen, die aus unterschiedlichen Regionen eines CRC-Tumors etabliert wurden, untersucht. Bei diesen Geschwister-3D-Zellkulturen handelt es sich um Patienten abgeleitete Organoide (engl. patient-derived organoids (PDO)), die die Architektur des Ursprungsgewebes zuverlässig rekapitulieren, sowie den genomischen Hintergrund und die intra-tumorale Heterogenität bewahren. Die Geschwister-PDO-Modelle teilten die häufigsten CRC-Mutationen, wie z.B. KRASG12D, unterschieden sich aber in einer homozygoten SMAD4R361H-Mutation und zeigten ein unterschiedliches Therapieansprechen. Die Einzelnukleotidvariante R361H des SMAD4-Gens gehört zu den häufigsten pathogenen Veränderungen bei verschiedenen Krebsarten. Ich konnte zeigen, dass von allen getesteten Zweit-Linien Therapien, die auf den MAPK-Signalweg abzielen, beide Modelle signifikante Unterschiede im Ansprechen auf die MEK-Inhibitoren Cobimetinib, Trametinib und Selumetinib aufwiesen. MEK-Inhibitoren sind antineoplastische Mittel, die die Funktion von MEK1 und MEK2 hemmen und somit die Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren verhindern. Dies führt zur Hemmung der Proliferation von Tumorzellen. MEK-Inhibitoren sind für die Therapie des malignen Melanoms zugelassen. Aufgrund der vielversprechenden Ergebnisse von MEK-Inhibitoren beim malignen Melanom wird aktiv an der Entwicklung von MEK-Inhibitoren gearbeitet, um deren Einsatz auf andere invasive Krebsarten, wie CRC, auszuweiten. Derzeit befinden sich MEK-Inhibitoren in einer Phase-III-Studie zur Behandlung von Patienten mit metastasiertem CRC. Zur Untersuchung, ob SMAD4R361H für die Sensitivität gegenüber MEK-inhibitoren verantwortlich ist, habe ich syngene CRC PDO-Modelle mit einer SMAD4R361H-Mutation mithilfe der CRISPR/Cas9-Methode etabliert. Ich habe gezeigt, dass die SMAD4R361H-Mutation für die Empfindlichkeit gegenüber MEK-Inhibition in CRC-Modellen verantwortlich ist und ein prädiktiver Biomarker sein könnte. Zur Überprüfung dieser Hypothese habe ich 62 CRC PDO-Modelle untersucht und mit den MEK-Inhibitoren Cobimetinib, Trametinib und Selumetinib behandelt. Alle Modelle, die eine pathogene Mutation oder Deletion im SMAD4-Gen aufwiesen (15 %), reagierten empfindlich auf Cobimetinib, 10 % der Modelle waren empfindlich gegenüber Trametinib und 8 % gegenüber Selumetinib. Zur mechanistischen Untersuchung habe ich Transkriptom- (RNA-Sequenzierung) und Proteom-analysen mittels der DigiWest®-Methode durchgeführt, mit der über 100 (Phospho-) Proteine gleichzeitig untersucht werden können. Die Transkriptom- und Proteomdaten stützen die Beobachtung, dass die MEK-Inhibition vor allem SMAD4R361H-PDO-Modelle betrifft. Darüber hinaus habe ich gezeigt, dass eine Aktivierung des BMP-Signalwegs in Organoiden mit Wildtyp SMAD4 für die Resistenz gegenüber MEK Inhibitoren verantwortlich zu sein scheint. Die BMP-Signalübertragung fördert die Proliferation von Krebszellen. Das heißt, eine genetische Veränderung im BMP-Signalweg, über SMAD4 hinaus, könnte zur Sensitivität gegenüber MEK-Inhibitoren führen. Ich habe vier Gene, die im TGF β/BMP Signalweg involviert sind und im CRC häufig mutiert vorkommen identifiziert und zur sogenannten SFAB-Signatur (SMAD4, FBXW7 , ARID1A oder BMPR2 ) zusammengefasst. Klinische Daten zeigen, dass etwa 36 % der CRC Patienten mindestens eine pathogene Mutation in diesen Genen aufweisen. Unter Verwendung einer Kontingenzanalyse habe ich eine signifikante Vorhersage der SFAB-Signatur auf die Sensitivität gegenüber den MEK-Inhibitoren Cobimetinib (95 %) und Selumetinib (70 %) gezeigt. Derzeit klinisch verwendeten Krebs-Biomarker im CRC basieren auf dem Mutationsstatus von KRAS und BRAF , die bis zu 50 % und 10 % im CRC vorkommen. Sowohl der RAS/RAF-Status allein als auch die Kombination des RAS/RAF-Status mit der SFAB-Signatur zeigten keine verbesserte Vorhersage der Empfindlichkeit gegenüber MEK-Inhibition. Das heißt, dass die SFAB-Signatur als möglicher prädiktiver Biomarker für die Krebstherapie dienen könnte. Sie zeigt als RAS/RAF-unabhängige Biomarker-Signatur mit hoher Wahrscheinlichkeit ein Ansprechen auf MEK-Inhibitoren an. Krebspatienten sollten daher vor der Behandlung auf die SFAB-Signatur getestet werden. Durch retrospektive und prospektive klinische Studien könnte diese Biomarker-Signatur validiert und in die Behandlungsrichtlinien von Krebspatienten aufgenommen werden.