Open Access

Fabian Thies

• In Deutschland werden jährlich gut drei Millionen Erythrozytenkonzentrate (EKs) transfundiert. Moderne Herstellungsmethoden und molekulare Diagnoseverfahren konnten die Sicherheit von Blutprodukten im Laufe der Jahre weiter verbessern. Wie bei jedem Medikament kann es nichtsdestotrotz bei der Therapie mit EKs zu Nebenwirkungen kommen. Dazu gehören unter anderem allergische Reaktionen, hämolytische und nicht hämolytische Transfusionsreaktionen, Übertragungen von Infektionskrankheiten und Eisenüberladung. Es werden weitere Nebenwirkungen postuliert, deren Zusammenhang mit Hämotherapie allerdings hinsichtlich einer möglichen Kausalität noch nicht abschließend untersucht wurde. Im Hinblick auf Malignompatienten zeigen retrospektive Untersuchungen eine deutliche Assoziation von Transfusionen und ungünstigem Behandlungsausgang. Diese Beobachtung könnte kausal oder durch Störfaktoren wie den medizinischen Umständen einer Transfusion oder patienteneigener Risikofaktoren erklärt werden. Während randomisierte Studien zur Überprüfung einer Kausalität sich aus ethischen Gründen verbieten, wurden mögliche Mechanismen aufgedeckt, die diese Assoziation erklären könnten. Dazu gehört unter anderem die transfusion-related immunomodulation (TRIM), an der auch erythrozytäre Mikropartikel (red blood cell-derived microparticles, RMPs) beteiligt sein könnten. RMPs sind extrazelluläre Vesikel (EVs), die von Erythrozyten bei der Apoptose und bei Einwirken verschiedener Stressoren gebildet werden. Bei der Prozessierung und Lagerung von EKs akkumulieren RMPs in unphysiologischer Menge, und möglicherweise sind diese RMPs anders als jene, die in vivo gebildet werden. Ob RMPs direkte Effekte auf Malignomzellen haben, wurde noch nicht untersucht. Das Forschungsgebiet rund um EVs ist relativ jung, weshalb noch keine echten Goldstandards bei Isolierung und Quantifizierung vorliegen. Während bei den RMPs hierfür am häufigsten Ultrazentrifugation (UZ) und Durchflusszytometrie verwendet werden, haben beide Methoden gewisse Einschränkungen. Mit der Größenausschlusschromatographie (size exclusion chromatography, SEC) liegt ein Verfahren vor, das sich bei anderen EVs als effektive Alternative zur UZ gezeigt hat und das zudem die Eigenschaften und biologischen Aktivitäten der empfindlichen EVs möglicherweise besser erhält. Ziel dieser Arbeit war es, im Zellkulturmodell zu untersuchen, ob RMPs aus EKs möglicherweise einen Einfluss auf Viabilität, Migration und Invasion maligner Zellen haben. Hierzu wurde die Kolonkarzinomzelllinie HCT-116 genutzt. Zudem sollte mit der SEC eine alternative Isolierungsmethode für RMPs etabliert werden und ein möglicher Einfluss der Isolierungsmethode auf die biologische Aktivität der RMPs untersucht werden. Insgesamt zeigte sich in den in vitro-Untersuchungen ein geringer Effekt von RMPs auf die Viabilität, Migration und Invasion von HCT-116-Zellen und dies auch nur in sehr hohen Konzentrationen, die in der Hämotherapie eines Patienten vermutlich nie erreicht werden. Es gilt, diese Beobachtungen in weiterführenden in vivo-Studien (zum Beispiel in Tiermodellen) zu verifizieren. Die SEC zeigte sich als gut geeignet zur Isolierung von RMPs im Hinblick auf die RMP-Ausbeute und die Auftrennung der RMPs von Proteinen. Die RMPs, die via SEC isoliert wurden, hatten im Gegensatz zu RMPs, die via UZ isoliert wurden, keinen Einfluss auf die Viabilität von HCT-116-Zellen. Die primäre Quantifizierungsmethode für RMPs war die Durchflusszytometrie, welche bei der Untersuchung kleiner EVs einige Einschränkungen hat, da die Auflösungsgrenze im Bereich der EV-Größe liegt. Ein Vergleich mit einer für EVs ausgelegten Technik, der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), zeigte, dass der Großteil der in den RMP-Isolaten enthaltenen Partikel in der Durchflusszytometrie nicht erkannt wird. Dieses Ergebnis könnte durch eine mangelhafte Sensitivität der Durchflusszytometrie, aber auch durch die Unspezifität der NTA erklärt werden. Es wurde in der NTA keine Färbung verwendet, daher konnten auch andere EVs und Partikel wie Lipoproteine mitgezählt werden.
• A good three million erythrocyte concentrates are transfused in Germany every year. Modern manufacturing methods and molecular diagnostic procedures were able to improve the security of blood products through the years. Nevertheless, as with every other medication, there are side effects of a therapy with erythrocyte concentrates. These include, inter alia, allergic reactions, hemolytic and non-hemolytic transfusion reactions, transmission of infectious diseases and iron overload. Other side effects are postulated, but their relation to hemotherapy has not been conclusively investigated concerning a possible causality. Regarding malignant tumor patients, retrospective studies show significant associations of transfusions and adverse outcome. This observation could be explained by confounders like the medical circumstances of a transfusion or the patients risk factors. While randomized studies for confirmation of a causality forbid for ethical reasons, some mechanisms have been revealed that could explain this association. These include transfusion-related immunomodulation (TRIM), that red blood cell-derived microparticles (RMPs) could be involved in. RMPs are extracellular vesicles (EVs) that are produced by erythrocytes during apoptosis and under the influence of various stressors. During processing and storage of erythrocyte concentrates, RMPs accumulate in an unphysiological quantity, and those RMPs are possibly different than those produced in vivo. It has not been investigated yet if RMPs have direct effects on malignant cells. The research area around EVs is relatively young, which is why there is no real gold standard for isolation and quantification. While ultracentrifugation and flow cytometry are mostly used for RMPs, both methods have certain limitations. Size exclusion chromatography (SEC) is a method that has been shown to be an effective alternative to ultracentrifugation for other EVs and it possibly preserves the properties and biological activities of the sensitive EVs better. The aim of this study was to investigate in cell culture if RMPs isolated from erythrocyte concentrates possibly have an influence on viability, migration and invasion of malignant cells. To this, the colorectal cancer cell line HCT-116 has been used. Also, the SEC should be established as an alternative isolation method for RMPs and a possible influence of the isolation method on the biological activity of RMPs should be assessed. Overall, the in vitro investigations showed a low influence of RMPs on viability, migration and invasion of HCT-116 cells, but only in very high concentrations that are probably never reached in the hemotherapy of a patient. These observations should be verified in further in vivo studies (for example in animal models). It appeared that SEC works well for RMP isolation concerning RMP yield and separation of RMPs from proteins. The RMPs isolated via SEC had no influence on the viability of HCT-116 cells in contrast to those isolated via ultracentrifugation. The primary method of quantification was flow cytometry, which has some limitations studying small EVs like RMPs, as the resolution limit is in the range of the EV size. A comparison to a method designed for EVs, nanoparticle-tracking-analysis (NTA), showed, that most particles in the RMP isolates were not detected in flow cytometry. This result could be explained by insufficient sensitivity of flow cytometry, but also by non-specificity of NTA. There were not used any dyes in NTA, so also other EVs and particles like lipoproteins could have been counted.