Open Access

Ines Katharina Müller

• The health status of every nucleated cell in the human body is monitored through peptides presented by major histocompatibility complex class I (MHC I) to T-cell receptors of CD8+ T-cells. Thereby, the adaptive immune system ensures the recognition and elimination of infected or cancerous cells. MHC I molecules comprise the polymorphic heavy chain (hc) and the light chain β2-microglobulin (β2m). More than 13,000 allomorphs of the MHC I hc have been identified. All MHC I hcs associate with β2m but differ in their binding preferences for peptides, ensuring the presentation of a large peptide pool. After maturation of MHC I hc/β2m heterodimers in the endoplasmic reticulum (ER), most of the peptide-deficient MHC I molecules are recruited to the peptide-loading complex (PLC). There, they go through peptide loading and editing before they are released as stable peptide-MHC I (pMHC I) complexes and traffic to the cell surface for antigen presentation. During the stringent quality control of MHC I peptide loading and editing within the PLC, the chaperone tapasin in conjunction with the oxidoreductase ERp57 stabilizes peptide-receptive MHC I molecules and alters the peptide cargo for high immunogenicity by catalyzing peptide-exchange. The tapasin-homologue TAP-binding protein related (TAPBPR) is involved in downstream quality control, editing the peptide repertoire of MHC I molecules that slipped through peptide proofreading by tapasin. Both chaperones were shown to adopt similar binding-modes for MHC I, suggesting related mechanisms of peptide editing. Nevertheless, the MHC I specific chaperones operate in different subcellular locations with differing assistance. While TAPBPR mediates peptide-exchange solely in the peptide-poor environment of the cis-Golgi and ER-Golgi intermediate compartment (ERGIC), tapasin functions mainly within the PLC together with ERp57 and the lectin-like chaperone calreticulin. Calreticulin with its lectin-, arm- and C-terminal domain contacts the MHC I heterodimer, ERp57 and the C-terminal domain of tapasin, respectively. Notably, the interaction site between calreticulin and tapasin has not yet been elucidated experimentally at molecular detail. The depletion of tapasin leads to a compromised immune response and a change in the pool of peptide cargo. The numerous MHC I allomorphs vary in their plasticity and their dependence on tapasin for the loading of optimal peptides. Moreover, the conformational plasticity of MHC I correlates with their dependence on tapasin. However, the molecular basis on how tapasin edits the various MHC I allomorphs and the structural features that are essential for peptide exchange catalysis at atomic resolution remained elusive. In the first part of this thesis, the trimeric complex of tapasin–ERp57/calreticulin was analyzed. To this end, laser induced liquid bead ionization mass spectrometry (LILBID-MS) was performed as part of a collaboration and revealed the trimeric assembly for tapasin–ERp57 and calreticulin. Furthermore, additional to a wildtype construct of calreticulin, a second construct, lacking the acidic helix of calreticulin that was found to come to close contact with tapasin, was utilized for isothermal titration calorimetry (ITC). A micromolar affinity of wildtype calreticulin to tapasin–ERp57 was determined. Previous biochemical and NMR studies utilizing the P-domain of calreticulin and solely ERp57 provided a micromolar affinity for the complex of calreticulin and ERp57. In this study, no interaction of calreticulin lacking the acidic helix with tapasin–ERp57 could be measured by ITC. However, these results undergo with findings that calreticulin lacking the acidic helix impairs the function of the PLC. Most likely, the negatively charged acidic helix is located in a groove of tapasin, carrying a more positive charge. Taken together, the functional data demonstrates the importance of the acidic helix of calreticulin for assembly of the trimeric subunit of calreticulin/tapasin–ERp57. In the main part of this study an MHC I–tapasin–ERp57 complex was structurally analyzed. Therefore, a photo-triggered approach was chosen to assemble the transient complex of MHC I–tapasin–ERp57. Various allomorphs were screened for complex formation with the tapasin–ERp57 heterodimer after photocleavage by size exclusion chromatography (SEC), resulting in mouse MHC I H2-Db as the suited allomorph. Microseed matrix screening was performed. Crystals diffracting X-rays to a resolution of 2.7 Å were obtained showing one tetrameric tapasin–ERp57–MHC I complex per asymmetric unit. The MHC I-chaperone structure shows molecular rearrangements upon MHC I engagement and unveils structural features of tapasin, involved in peptide-exchange catalysis...
• Der „Gesundheitszustand“ jeder menschlichen, zellkernhaltigen Zelle wird durch Oberflächen-Präsentation von Peptiden über Klasse I Haupthistokompatibilitätskomplexe (major histocompatibility complex class I, MHC I) an T-Zell-Rezeptoren von CD8+ T-Zellen vermittelt. Auf diese Weise kann das adaptive Immunsystem infizierte oder krebsartige Zellen erkennen und eliminieren. MHC I Moleküle setzen sich aus einer polymorphen, schweren Kette (heavy chain, hc) und einer invarianten, leichten Kette, dem β2-Mikroglobulin (β2-microglobulin, β2m), zusammen. Bisher wurden bereits mehr als 13.000 hcs, auch Allomorphe genannt, identifiziert. Sie assoziieren mit β2m, weisen aber unterschiedliche Bindungspräferenzen für Peptide auf, wodurch die Präsentation eines großen Peptidpools in einer Population gewährleistet wird. Nach der Reifung von MHC I hc/β2m-Heterodimeren im Endoplasmatischen Retikulum (ER) werden MHC I Moleküle, die über keine Peptide verfügen, zum Peptidbeladungskomplex (peptide loading complex, PLC) rekrutiert. Im PLC führt der Prozess des sogenannten Peptideditierens (peptide editing) dazu, dass MHC I Moleküle mit optimalen Peptiden beladen werden, welche dann als Peptid-MHC I Komplexe den PLC verlassen und zur Antigenpräsentation an die Zelloberfläche gelangen. Während der strengen Qualitätskontrolle der MHC I Peptidbeladung und -bearbeitung innerhalb des PLC, stabilisiert das Hilfsprotein Tapasin, als Disulfid-verbrückter Heterodimer mit der Oxidoreduktase ERp57, unbeladene MHC I Moleküle. Tapasin katalysiert ferner das peptide editing und sorgt so für die Selektion und Beladung von MHC I Molekülen mit hochaffinen und immunogenen Peptiden. Das Homolog von Tapasin, TAPBPR (engl. TAPbinding protein related, TAPBPR), ist wahrscheinlich in ähnlicher Weise wie Tapasin an der Qualitätskontrolle von MHC I Molekülen beteiligt, indem es die Peptide von MHC I Molekülen, die dem Editierungsprozess von Tapasin entkommen sind, bearbeitet. Es wurde gezeigt, dass beide Hilfsproteine MHC I Komplexe in ähnlichen Konformationen binden, weshalb vermutet wird, dass sie auch einen ähnlichen Mechanismus für das peptide editing anwenden. Die beiden Hilfsproteine weisen jedoch unterschiedliche subzelluläre Lokalisierungen auf. Während TAPBPR den Peptidaustausch ausschließlich in der peptidarmen Umgebung des cis-Golgi und des ER-Golgi Zwischenkompartiments (ER/Golgi intermediate compartment, ERGIC) katalysiert, arbeitet Tapasin hauptsächlich innerhalb des PLC zusammen mit ERp57 und dem Hilfsprotein Calreticulin. Calreticulin hat eine zentrale, Lektin-ähnliche Domäne, welche für den Kontakt zum MHC I-Glykan wichtig ist und kontaktiert mit seiner Prolin-reichen Arm-Domäne die Oxidoreduktase ERp57 und mit seiner sauren C-terminalen Domäne das Hilfsprotein Tapasin. Zu erwähnen ist, dass die Interaktion zwischen Calreticulin und Tapasin bisher noch nicht im molekularen Detail beschrieben werden konnte. Die Depletion von Tapasin führt zu einer Beeinträchtigung der Immunantwort und zu einer Veränderung des präsentierten Peptidpools. Die zahlreichen MHC I Allomorphe unterscheiden sich in ihrer Plastizität und ihrer Abhängigkeit von Tapasin für die Beladung mit optimalen Peptiden. Darüber hinaus korreliert die konformationelle Plastizität von MHC I mit ihrer Abhängigkeit von Tapasin. Der molekulare Mechanismus des Editierens der verschiedenen Peptid/MHC I-Allomorphe durch Tapasin, sowie die hierzu verwendeten strukturellen Elemente des Hilfsprotein, sind jedoch nicht vollständig beschrieben. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Komplex bestehend aus einem disulfidvernetzten Tapasin–ERp57-Heterodimer und dem Protein Calreticulin analysiert. Im Rahmen einer Kollaboration wurde der Aufbau des trimeren Komplexes mittels laser-induced-liquid-bead ionization (LILBID)-Massenspektroskopie (MS) bestimmt. Für isothermische Titrationskalorimetrie (ITC) wurde neben dem Wildtyp-Calreticulin eine Deletionsmutante verwendet, bei welcher die saure C-terminale Helix, die die Bindung zu Tapasin vermittelt, entfernt wurde. Es wurde eine mikromolare Affinität von Wildtyp (WT)-Calreticulin zu Tapasin–ERp57 bestimmt. In biochemischen und NMR-Studien, bei denen die Arm-Domäne von Calreticulin und ERp57 (ref.) verwendet wurden, konnte eine Affinität im mikromolaren Bereich zwischen der Arm-Domäne von Calreticulin und ERp57 festgestellt werden. In dieser Arbeit wurde keine Interaktion zwischen der Calreticulin-Deletionsmutante ohne die saure Helix mit Tapasin–ERp57 mittels ITC nachgewiesen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit den Erkenntnissen, dass Calreticulin, dem die saure Helix fehlt, die Funktion des PLCs beeinträchtigt. Wahrscheinlich befindet sich die negativ geladene Helix in einer Furche von Tapasin, die eine überwiegend positive Ladung trägt. Zusammengefasst zeigen die funktionellen Daten die Bedeutung der sauren Helix von Calreticulin für den Aufbau des trimeren Calreticulin/Tapasin–ERp57 Komplex...