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David Villinger

• Bartonella henselae (B. henselae) ist ein zoonotischer humanpathogener Erreger, der die Katzenkratzkrankheit sowie andere Infektionskrankheiten verursacht. Trotz des globalen Auftretens sind epidemiologische Daten rar oder beruhen auf geringen Fallzahlen. Die aktuelle Forschung zu Bartonellen zielt mehr und mehr auf einen interdisziplinären Ansatz, der als one-health-Konzept zusammengefasst werden kann und als solcher zunehmend Daten zur Seroprävalenz mit hohen Fallzahlen benötigt. Die Detektion von anti-B. henselae IgG-Antikörpern mittels indirektem Immunfluoreszenztest (IFT) ist die Diagnostik der Wahl für Bartonella-Infektionen. Dabei handelt es sich um ein objektträgerbasiertes Verfahren, wodurch dessen Handhabung ungeeignet für die Verarbeitung im Hochdurchsatz wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der high-throughput IFT (hpIFT) zum Nachweis von anti-B. henselae IgG-Antikörpern im 96-Well-Platten-Format entwickelt, welcher es zum ersten Mal ermöglicht, seroepidemiologische Daten mit hohen Fallzahlen zu generieren. Für die Antigenpräparation im 96-Well-Platten-Format wurden HeLa 229-Zellen mit B. henselae [Houston-1 RSE 247 (BadA-)-Stamm] infiziert, fixiert, blockiert und permeabilisiert. Humane Seren wurden 1:320 verdünnt. Nach Inkubation der Seren folgte die Zugabe von Sekundärantikörpern. Für die genannten Schritte wurde ein einfacher, ökonomischer Workflow unter Zuhilfenahme des Pipettierroboters VIAOFLO 96/384 von Integra erstellt. Mit dem entwickelten hpIFT wurden insgesamt 5.215 Proben verarbeitet. Alle Seren wurden bei einem cut-off-Wert von 1:320 bewertet, dabei galten Werte von ≥ 1:320 als positiv. Um die diagnostische Validität zu überprüfen, wurden zunächst 20 bekannte Seren in unterschiedlichen Titerstufen und anschließend 238 zufällig ausgewählte Blutspendeseren mit der kommerziellen objektträger-basierten IFT-Methode von Euroimmun (Produktcode: FK-219b-1010-1G) verglichen. Zur Überprüfung der Intraspezies-Kreuzreaktivität wurden verschiedene B. henselae-Stämme [Houston-1 RSE 247 (BadA-), Marseille (BadA+), Houston-1 MFE341 (BadA+), Marseille (BadA-)] und B. quintana-Stämme [JK31 (Vomp+) und 2D70(Vomp-)] als Antigen mit unterschiedlichen, in der Antikörperkonstellation bekannten Seren untereinander verglichen. Um die Interspezies-Kreuzreaktivitäten abzuklären, wurden Seren mit hohen IgG-Antikörpern gegen andere Pathogene (Anaplasma phagocytophilum, Leptospira spp., Brucella spp., Coxiella burnetii, Rickettsia typhi, Treponema pallidum, Mycoplasma pneumoniae, Epstein-Barr-Virus und B. quintana) überprüft. Es zeigte sich, (I) dass der modifizierte hpIFT mit beinahe gleichwertiger Sensitivität (86,2 %) und Spezifität (80,6 %) verglichen mit dem kommerziell erhältlichen IFT von Euroimmun bei umfangreichen Probenmengen ein ökonomisches, vergleichsweise einfach zu bedienendes, zuverlässiges und präzises Verfahren zur Detektion von anti-B. henselae IgG-Antikörpern in humanen Seren darstellt und (II), dass die ermittelte anti-B. henselae IgG-Prävalenz von 22,3 % unter 5.215 Blutspenderinnen und Blutspendern verglichen mit weltweit publizierten Studien vergleichbarer Kohorten der letzten Jahre höher ausfällt als angenommen. Der hier etablierte hpIFT stellt damit ein vielversprechendes Tool für die Hochdurchsatz-Serologie zum Nachweis von anti-B. henselae-Antikörpern in Prävalenzstudien dar. Eine weitere Modifizierung beispielsweise für den veterinären Bereich könnte im Sinne des one-health Ansatzes neue Möglichkeiten für epidemiologische Forschungsaspekte eröffnen.
• Bartonella henselae (B. henselae) is a zoonotic pathogen causing cat scratch disease and other infectious diseases. Despite its global occurrence, epidemiological data are rather sparse or only represent small sample numbers. Present research on Bartonella spp. follows an interdisciplinary approach that can be summarized as the one health concept, and needs seroprevalence data with high case numbers. Detection of anti-B. henselae IgG antibodies by indirect immunofluorescence assay (IFA) is the diagnostic of choice in Bartonella infections. These tests are microscopy-slide based and handling is therefore inconvenient when processing larger sample numbers. In this study the high-throughput screening assay (hpIFT) for the detection of anti-B. henselae IgG antibodies using 96-well plates was designed and made it possible for the first time to generate seroepidemiological data of B. henselae infections on a larger scale. Using the 96-well plate format for antigen preparation HeLa 229-cells were infected with B. henselae [Houston-1 RSE 247 (BadA-) strain], fixed, blocked and permeabilized. Human sera were diluted by 1:320. After incubating the sera, secondary antibodies were added. For all steps an easy, economical workflow was created that included pipetting-robot VIAOFLO 96/384 of Integra. With the developed hpIFT a total amount of 5.215 sera were processed. All sera were assayed at a cut-off titer of 1:320 and results ≥ 1:320 were evaluated as positive. To check the diagnostic validity, firstly, 20 familiar sera in different dilutions were tested and, secondly, 238 randomly picked blood donor sera were counterchecked with Euroimmun`s slide-based IFA (product code: FK-219b-1010-1G). To assess the intraspecies crossreactivity, different B. henselae strains [Houston-1 RSE 247 (BadA-), Marseille (BadA+), Houston-1 MFE341 (BadA+), Marseille (BadA-)] and B. quintana strains [JK31 (Vomp+) and 2D70(Vomp-)] were prepared as antigen and were compared using different antibody constellations of sera. To evaluate the interspecies-crossreactivity sera with high IgG antibody titer against other pathogens (Anaplasma phagocytophilum, Leptospira spp., Brucella spp., Coxiella burnetii, Rickettsia typhi, Treponema pallidum, Mycoplasma pneumoniae, Epstein-Barr-Virus und B. quintana) were evaluated. Results showed that (I) the modified hpIFT, with nearly the same value of sensitivity (86,2 %) and specificity (80,6 %) compared with the commercially available IFT from Euroimmun, proved to be an economic, comparably easy-to-handle, reliable method to detect anti-B. henselae IgG antibodies in large scale sample sizes and (II) that the investigated anti-B. henselae IgG prevalence of 22,3 % amongst 5.215 blood donors is higher than expected, compared to worldwide studies within similar cohorts of recent years. The here established hpIFT already shows to be a promising tool in high-throughput serology for the detection of anti-B. henselae-antibodies in seroprevalence studies. Modifications, for example for the veterinary field, could open up new possibilities in epidemiological research aspects in the context of one-health.