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Thiruvenkadam Shanmugam

• Ribosome biogenesis is a fundamental cellular process beginning with long precursor rRNA transcription from multi-copies of repetitive 45S ribosomal DNAs. At the subunit level, the primary pre-rRNA transcript encapsuled in 90S protein-RNA complex undergoes decisive splitting in two chief ways for further maturation into large (LSU) and small (SSU) ribosomal subunit. The usage of specific rDNA copies from defined chromosomes and their selective role during growth and development have been a topic of interest owing to its contribution to specialized ribosome theory which proposes non-monolithic functions for ribosomes and thereby their mRNA translation potential. Dual-guide CRISPR/Cas9 mediated disruption of rDNA regions resulted in stable disruption of up to 2.5% and 5% of all rDNA copies in hetero- and homozygous (ploop KD) conditions, respectively. At the RNA level, the mutation excised a critical structural element, P-loop on the LSU 25S rRNA. Mutation caused a dosage dependent defect with homozygosity leading to severe developmental defects through vegetative and reproductive growth phases which is manifested in their proteome by means of disregulation through both increase and decrease of several gene ontological categories of proteins in mutants. Interestingly, the mutation on chromosome 4 triggered dosage compensation through rRNA expression from chromosome 2 further compounded by ectopic rRNA biogenesis defects. The mutated copies however are not incorporated in the translating ribosomes and as a direct or indirect consequence led to elevated basal autophagic levels in the mutants. The primary 35S transcript is known to undergo two modes of initial cleavages at the pre-rRNA level that aid in their subsequent maturation. Root cell culture (RCC) studies shows that these cells contain a novel ITS2-first cleaved precursor even under control growth conditions, P-C2 adding a third maturation means for the 35S pre-rRNA. This maturation path is further known to be triggered under elevated growth temperature forming a novel adaptive response in Arabidopsis and two other crop plants, tomato, and rice. Taken together, the pulse-chase labeling analysis of control and stressed tissues uncovers the fine-tuned pre-rRNA schematics with crossovers between multiple maturation paths.
• Die Ribosomenbiogenese ist ein mehrstufiger und multikompartimenteller Reifungsprozess, der sich über drei wichtige Organellen erstreckt. Er beginnt im Nukleolus und setzt sich im Nukleoplasma und im Zytoplasma fort. Für diesen Prozess sind die Aktivitäten aller drei großen RNA-Polymerasen erforderlich. So ist beispielsweise die Aktivität von RNA pol II für die Transkription von Hunderten von mRNAs erforderlich, die für die Bestandteile der ribosomalen Proteine (RP) und mehrere andere Proteine kodieren, die am Ribosombiogeneseprozess beteiligt sind und als ribosomale Biogenesefaktoren (RBFs) bezeichnet werden. Da die Ribosomenproduktion die gesamte Transkriptionsleistung dominiert und je nach Wachstumsstadium bis zu 80 % der gesamten Transkription einer bestimmten Zelle ausmacht, werden die genomischen DNA-Regionen (ribosomale DNA, rDNA), die für ribosomale RNAs kodieren, in der Regel durch mehrere Kopien repetitiver Regionen kodiert, die im Fall der Modellpflanze Arabidopsis Hunderte von Kopien umfassen. Je nach Organismus sind diese Kopien in der Regel tandemförmig auf einem oder mehreren Chromosomen angeordnet. Der Prozess der Biogenese selbst beginnt mit der Transkription dieser rDNA-Kopien durch eine spezielle Polymerase, RNA Pol I, in den nukleolär organisierenden Regionen (NORs). In Arabidopsis sind die rDNAKopien in den NOR-Regionen der Chromosomen 2 und 4 verteilt, die als NOR2 und NOR4 bezeichnet werden. Während diese rDNA-Kopien im Prinzip als analog zueinander bezeichnet werden, gibt es innerhalb der rDNA-Kopien selbst Polymorphismen in Bezug auf die Länge der 3'-Transkriptionsbereiche (3'-ETS), durch die sie in die Untervarianten 1-4 (Var1-Var4) eingeteilt werden. Diese NORs können in Abhängigkeit des Entwicklungsstadiums einzigartige Chromatin-Konfigurationen aufweisen, die durch Chromatin-Aktivierungs- oder Silencing-Markierungen auf Histonen und DNA-Sequenzen vermittelt werden. Dies führt zu einer variablen Transkription von rDNA-Kopien mit für Entwicklungsstadien spezifischen Variantenprofilen. Nach der Transkription der rDNA-Kopien enthält der transkribierte Vorläufer der ribosomalen RNA (rRNA) unreife Regionen zwischen reifen rRNA-Arten, und bildet den so genannten 90S-Komplex. In Arabidopsis werden die reifen rRNA-Regionen, 18S, 5.8S und 25S, auf beiden Seiten von external transcribed sequences (5'-ETS und 3'-ETS) flankiert, während sie intern durch internal transcribed sequences (ITS1und ITS2) getrennt sind. Die Reifung dieses 90S-Komplexes, der die primäre 35STranskript-prä-rRNA enthält, wurde hauptsächlich durch erste Spaltungsschritte entweder an ITS1 oder 5'-ETS beschrieben. Abhängig von der Menge der resultierenden Transkripte im ausgewogenen Gleichgewicht (steady-state) wurden diese Wege als Major-Pathway ("major ITS1-first") und Minor-Pathway ("minor 5'- ETS-first") charakterisiert, wobei der Major-Pathway zu P-A3 und der Minor-Pathway zu 32S-Transkripten führt. Die resultierenden Transkripte dienen als diagnostische Vorläufer für die entsprechenden Reifungswege. Diese deterministischen Stellen sind das Resultat der endonukleolytischen Spaltung und des exonukleolytischen Trimmens konservierter Stellen der unreifen prä-rRNA-Regionen...