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Christian Winter

• The human body is permanently exposed to its environment and thus to viruses and other pathogens, which require a flexible response and defense. Alongside to the innate immune system, the adaptive immune system provides highly specialized protection against these threats. The major histocompatibility complex class I (MHC I) antigen presentation system is a cornerstone of the adaptive immune system and a major constituent of cellular immunity. Pathogens such as viruses that invade a cell will leave traces in the form of proteins and peptides which are degraded and loaded onto MHC I molecules. MHC I peptide loading is performed by peptide loading complex (PLC) in the membrane of the endoplasmic reticulum as part of a multifaceted and comprehensive quality control machinery. Monitored by multiple layers of quality assurance, the MHC I molecules consequently display the immune status of the cell on its surface. In this context, the captured fragment of the virus serves as a call for help issued by the cell, alerting the adaptive immune system to the infection to mount an appropriate immune response. The three-dimensional structure as well as the mechanistic details of parts of this complex machinery were characterized in the context of this dissertation. Among other tools, light-modulable nanotools were developed in this thesis, which permit external regulation of cellular processes in temporal and spatial resolution. Furthermore, methods and model systems for the biochemical characterization of cellular signaling cascades, proteins, as well as entire cell organelles were developed, which are likely to influence the field of cellular immunity and protein biochemistry in the future. This cumulative work comprises a total of six publications whose scientific key advances will be briefly outlined in this abstract. In the introduction, the scientific background as well as the current state of research and methodological background knowledge are conveyed. The results section condenses the main aspects of the publications and links them to each other. Further details can be retrieved from the attached original publications. In “Semisynthetic viral inhibitor for light control of the MHC I peptide loading complex, Winter, Domnick et al., Angew Chem Int Ed 2022” a photocleavable viral inhibitor of the peptide loading complex was produced by semi-synthesis. This nanotool was shown to be suitable for both purifying the PLC from human Raji cells as well as reactivating it in a light-controlled manner. Thus, this tool establishes the isolation of a fully intact and functional peptide loading complex for biochemical characterization. In addition, a novel flow cytometric analysis pipeline for microsomes was developed, allowing cellular vesicles to be characterized with single organelle resolution, similar to cells. In “Molecular basis of MHC I quality control in the peptide loading complex, Domnick, Winter et al., Nat Commun 2022” the peptide loading complex was reconstituted into large nanodiscs, and a cryo-EM structural model of the editing module at 3.7 Å resolution was generated. By combining the structural model with in vitro glycan editing assays, an allosteric coupling between peptide-MHC I assembly and glycan processing was revealed, extending the known model of MHC I loading and dissociation from the PLC. These mechanisms provide a prototypical example for endoplasmic reticulum quality control. In a related context, in “Structure of an MHC I–tapasin–ERp57 editing complex defines chaperone promiscuity, Müller, Winter et al., Nat Commun 2022” a recombinantly assembled editing module comprised of MHC I-tapasin-ERp57 was crystallized for X-ray structural biology. The resulting crystal structure at a resolution of 2.7 Å permitted the precise identification of characteristic features of the editing module and particularly of the peptide proofreading mechanism of tapasin. This study provided pivotal insights into the tapasin-mediated peptide editing of different MHC I allomorphs as well as similarities to TAPBPR-based MHC I peptide proofreading. In “TAPBPR is necessary and sufficient for UGGT1-mediated quality control of MHC I, Sagert, Winter et al. (in preparation)” novel insights concerning the peptide proofreader TAPBPR and its close interplay with the folding sensor and glucosyltransferase UGGT1 were obtained. It was shown that TAPBPR is an integral part of the second level of endoplasmic quality control and is indispensable for effective MHC I coordination by UGGT1. In “Light-guided intrabodies for on-demand in situ target recognition in human cells, Joest, Winter et al., Chem Sci 2021” intracellular nanobodies were equipped with a photocaged target recognition domain by genetic code expansion via amber suppression. These intrabodies, acting as high-affinity binding partners endowed with a fluorophore, could be used in a light-triggered approach to instantaneously visualize their target molecule...
• Der menschliche Körper ist permanent seiner Umwelt und damit auch Viren und anderen Krankheitserregern ausgesetzt, die eine flexible Reaktion und Abwehr erfordern. Er muss jedoch auch intelligent auf endogene Bedrohungen wie entartete Zellen reagieren, während eine klar definierte Unterscheidung zwischen eigenen und fremden Entitäten jederzeit aufrechterhalten werden muss, um Autoimmunerkrankungen zu vermeiden. Das Immunsystem hat daher zahlreiche Barrieren wie die Schleimhäute entwickelt, um das Eindringen von Krankheitserregern zu verhindern, aber auch humorale und zelluläre Abwehrstrategien, um deren systemische Ausbreitung einzudämmen. Neben dem angeborenen Immunsystem, bietet das adaptive Immunsystem einen hochspezialisierten Schutz gegen diese Bedrohungen. Das MHC I-Antigenpräsentations-system ist ein Eckpfeiler des adaptiven Immunsystems und ein Hauptbestandteil der zellulären Immunität. Krankheitserreger wie Viren, die in eine Zelle eindringen, hinterlassen dort Spuren in Form von Peptiden und Proteinen, die proteasomal abgebaut und auf MHC I- Moleküle geladen werden können. Dies geschieht durch den Peptide Loading Complex in der Membran des endoplasmatischen Retikulums als Teil einer vielschichtigen und umfassenden Qualitätskontrollmaschinerie. Ein wesentlicher Aspekt dieser Qualitätsüberwachung ist die Visualisierung des Faltungsstatus von MHC I über das angelagerte Glykan. Die MHC I-Moleküle, die durch mehrere Schichten der Qualitätssicherung, sowohl im endoplasmatischen Retikulum als auch im Golgi-Apparat kontrolliert werden, zeigen daraufhin den Immunstatus der Zelle auf ihrer Oberfläche an. In diesem Zusammenhang dient das eingefangene und präsentierte Proteinbruchstück als Hilferuf der Zelle, um das adaptive Immunsystem auf die Infektion aufmerksam zu machen und eine Immunreaktion einzuleiten. Zu einer solchen Immunreaktion zählen der programmierte Zelltod und die Rekrutierung von Effektorzellen des adaptiven und des angeborenen Immunsystems. Sowohl die dreidimensionale Struktur des Peptide Loading Complex als auch die mechanistischen Details dieser komplexen Maschinerie wurden im Rahmen dieser Dissertation charakterisiert. Zu diesem Zweck wurden die Komponenten des Komplexes entweder aus menschlichen Immunzellen extrahiert und in ein geeignetes Membranmimetikum rekonstituiert oder rekombinant exprimiert und in vitro assembliert. Mit modernsten strukturbiologischen Techniken wie kryogene Elektronenmikroskopie und Röntgenkristallographie konnte die räumliche Anordnung der Moleküle mit atomistischer Auflösung entschlüsselt werden. Weiterhin wurden Biomoleküle künstlich durch lichtempfindliche Bestandteile erweitert. Anschließend konnte Licht als bioorthogonaler Impulsgeber genutzt werden, um diese Moleküle entweder zu zerstören und damit ihre biologische Funktion aufzuheben oder sie zu aktivieren und damit an ihren Zielort zu dirigieren. Dadurch konnten komplexe zelluläre Prozesse mit räumlicher und zeitlicher Auflösung durch Laserpulse gesteuert werden. Darüber hinaus wurden Methoden und Modellsysteme zur biochemischen Charakterisierung von zellulären Signalkaskaden, Proteinen sowie ganzen Zellorganellen entwickelt, die auch in Zukunft auf dem Gebiet der zellulären Immunität und der Proteinbiochemie ihren Nutzen finden werden. Diese kumulative Arbeit umfasst insgesamt sechs Publikationen, deren wissenschaftlicher Beitrag in dieser Zusammenfassung kurz skizziert werden soll. In der Einleitung werden der wissenschaftliche Hintergrund, der aktuelle Stand der Forschung und methodisches Hintergrundwissen vermittelt. Der Ergebnisteil fasst die wesentlichen Aspekte der Publikationen zusammen und verknüpft sie miteinander. Weitere Details können den beigefügten Originalpublikationen am Ende der Arbeit entnommen werden. In „Semisynthetic viral inhibitor for light control of the MHC I peptide loading complex, Winter, Domnick et al., Angew Chem Int Ed 2022” wurde ein lichtspaltbarer viraler Inhibitor des Peptide Loading Complex durch Semisynthese hergestellt. Der virale Inhibitor bindet spezifisch an die Peptidbindungstasche der Transporteinheit des Peptide Loading Complex und blockiert diese, wodurch der Komplex irreversibel in seiner Konformation fixiert wird und nicht mehr in der Lage ist, dem endoplasmatischen Retikulum weiterhin Peptide zuzuführen. Dieser Mechanismus ist Teil moderner Isolationsstrategien, bei denen der PLC mittels Affinitätschromatographie mit diesem modifizierten viralen Inhibitor aus menschlichen Zellen präpariert wird. Ein großes Problem bei diesem Ansatz ist die irreversible Hemmung der Transportfunktion, die eine weitere biochemische Charakterisierung einschränkt. Da der Einbau von unnatürlichen Aminosäuren, dessen Peptidrückgrat durch Licht spaltbar ist, in vivo nicht möglich ist, wurde der virale Inhibitor in zwei Teile zerlegt und teil-synthetisch und sowie teil-rekombinant hergestellt...