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Jessica Lena Peter

• Die Entartung von B-Zellen stellt den Ursprung vieler maligner Erkrankungen dar. Bei der Prä-B-Zell-ALL, welche 15 % der malignen Erkrankungen im Kindesalter ausmacht, findet die Entartung auf der Entwicklungsstufe der Prä-B-Zellen statt. In der normalen Hämatopoese fungiert der Prä-BZR als Kontrollpunkt in der Entwicklung der B-Zellen, weshalb der Rezeptor sowie die von ihm ausgehenden Signalwege bereits bei vielen hämatologischen Neoplasien als therapeutische Ansatzpunkte in Betracht gezogen wurden. Der Prä-BZR selbst stellt einen Tumorsuppressor dar: Etwa 13,5 % der Prä-B-Zell-ALL sind von einem aktiven Prä-BZR-Signal abhängig. In entarteten Zellen findet oftmals eine Imitation der Proliferationssignale eines konstitutiv aktiven BZRs statt. Bei Zellen ohne einen funktionellen Rezeptor führt die Rekonstruktion des Rezeptors jedoch zum Zelltod. Sowohl ein zu hohes als auch ein zu niedriges Aktivitätsniveau des Prä-BZRs haben somit einen negativen Effekt auf das Wachstumsverhalten der Zellen zur Folge. Wichtige downstream des Prä-BZRs vorkommende Effektormoleküle sind die Histonmethyltransferase DOT1L und der Tumorsuppressor BRD7. DOT1L interagiert mit dem Transkriptionsfaktor AF10, der eine bedeutsame Rolle bei der Entstehung von Mixed-lineage-Leukämien spielt; eine DOT1L-Inhibition zeigt daher auch nur bei MLL-rearrangierten Leukämien therapeutische Effekte. In dieser Dissertationsarbeit konnte der Tumorsuppressorphänotyp von BRD7 aufgezeigt werden. Außerdem zeigten sich Effekte auf den PI3K- sowie den MEK-Signalweg durch Dephosphorylierung der Kinasen AKT und ERK. Dieser Aspekt kann mithilfe einer hypothetischen Feedback-Schleife zwischen BRD7, dem PI3K-Signalweg sowie dem Prä-BZR erklärt werden. BRD7 und Gene des PI3K-Signalwegs könnten hierbei über Chromatin-Remodellierung miteinander interagieren. Die Analyse der Phosphosite von BRD7 stellt einen essenziellen Aspekt dar, um diese Feedback-Schleife experimentell zu validieren. Auf der anderen Seite führte auch die Inaktivierung von BRD7 zu negativen Effekten auf das Wachstumsverhalten der Zellen. Ähnlich wie der Transkriptionsfaktor TCF3, der einen oberen Schwellenwert besitzt, könnte BRD7 einen unteren Schwellenwert besitzen, unter welchem wachstumshemmende Effekte hervorgerufen werden. Außerdem sind auch proapoptotische Wirkungen für eine Überaktivierung des ERK- und des AKT-Signalwegs beschrieben worden, beispielsweise über die Hemmung des AKT-Inhibitors PTEN. Durch massenspektrometrische Analysen konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von BRD7 die Komplexe der mitochondrialen Atmungskette hochreguliert. Die proliferationshemmenden Effekte des PI3K-Signalwegs überwiegen jedoch vermutlich diese positiven Effekte auf die Energiegewinnung der Tumorzellen. Alternativ könnte es sich in den Tumorzellen lediglich um einen Kompensationsmechanismus bei geschädigter oxidativer Phosphorylierung handeln. Bei der Analyse der molekularen Hintergründe des Wachstumsnachteils der BRD7-überexprimierenden Zellen konnte festgestellt werden, dass die Prä-B-Zellen RCH-ACV vom PI3K-Signalweg, jedoch nicht vom MEK-Signalweg abhängig sind. Es ist denkbar, dass noch weitere Moleküle reguliert werden müssen, damit die Modifikation des MEK-Signalwegs Effekte auf das Wachstumsverhalten und Überleben der Zellen ausübt. In dieser Arbeit konnten der Prä-BZR und die von ihm ausgehenden Signalwege als gute Ansatzpunkte bei der Therapie der Prä-B-Zell-ALL identifiziert werden. Zwar zeigten sich bei Überexpression und Inhibition von BRD7 nur Effekte auf die Proliferation der Zellen, jedoch existieren vielfältige Interaktionen mit upstream lokalisierten Signalmolekülen (hypothetische Feedback-Schleife). Die dadurch angestoßenen Signalwege können zur Einleitung der Apoptose beitragen. Prinzipiell könnte der Tumorsuppressor BRD7 therapeutisch durch das Designen von Kinasen eingesetzt werden, welche eine gezielte Phosphorylierung und damit konstitutive Aktivierung von BRD7 bewirken, jedoch stellt der Einsatz von etablierten, weiter upstream ansetzenden Kinase-Inhibitoren einen effektiveren therapeutischen Ansatzpunkt zur Apoptoseeinleitung im Patienten dar.
• Acute lymphoblastic leukemia derives from progenitor cells of b-cells. Pre-b-cell ALL accounts for 15% of malignancies in childhood. Due to the pre-b-cell receptor role as a checkpoint in the development of b-cells, pre-bcr and its signaling pathways have already been used as a therapeutical target in ALL for years. The pre-bcr acts as a tumor suppressor and 13.5% of all pre-b-cell ALL depends on pre-bcr signaling. Imitation of the proliferation signals of a functional bcr often takes place in malignant cells. However, reconstitution of the pre-bcr in cells lacking a functional receptor leads to induction of apoptosis. Overactivation as well as deficient activation levels show negative effects on cell proliferation. Histone methyltransferase DOT1L and regulator protein BRD7 are crucial proteins downstream of the pre-bcr. DOT1L interacts with the transcription factor AF10, which plays an important role in the pathogenesis of mixed lineage leukemia. Hence, inhibition of DOT1L displayed effects in MLL rearranged cells only. In this thesis we were able to reveal the tumor suppressor phenotype of BRD7. BRD7 overexpression decreased pAKT and pERK levels and inhibited cell proliferation. These effects are due to a hypothetical feedback loop between the pre-bcr, BRD7 and the PI3K signaling pathway. It is possible that interaction between BRD7 and PI3K genes works via chromatin remodeling. To validate this feedback loop, the phosphosite of BRD7 should be further investigated. Nevertheless, knockdown of BRD7 also led to restricted cell proliferation while phosphorylation of AKT and ERK was enhanced. It is possible that BRD7 limits cell growth when it falls below a certain threshold – similar to the known upper threshold of the transcription factor TCF3. Furthermore, it is described that hyperactivation of MEK and AKT signaling pathways also induces apoptosis – e.g. via inhibition of PTEN, an inhibitor of AKT. Mass spectrometry analysis showed enhanced expression of proteins of the respiratory chain in BRD7 overexpressing cells. The negative effects of a decreased activation of the PI3K signaling pathway though will probably outweigh the impact of the oxidative phosphorylation. Furthermore, it could also be a compensation mechanism of an impaired respiratory chain. Analysis of molecular pathways showed that the pre-b-cells RCH-ACV depend on PI3K signaling but not MEK signaling. Regulation of additional proteins may affect proliferation and survival when inhibiting the MEK signaling pathways. All in all, the results of this thesis support the fact that pre-bcr and its signaling pathways are crucial targets in therapy of pre-b-cell-ALL. Overexpression or inhibition of BRD7 only affected proliferating cells. However, due to diverse interactions like the mentioned feedback loop, apoptosis may be induced as well. Regarding its tumor suppressor phenotype, BRD7 can theoretically be used as a therapeutical target in pre-b-cell ALL. By designing kinases, it could be phosphorylated and therefore constitutively activated, but in vivo the use of well-established kinase inhibitors against the pre-bcr signaling pathways might be more realistic.