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Felix Rohde

• Electrospinning is an advanced method for the generation of polymer-based fibers. This fabrication technique has gained great interest in the biomedical field in recent years due to its straightforward application and significant versatility of the resulting fiber mats. The process is carried out by dissolving a (biologically or synthetically derived) polymer or a combination of several polymers in a suitable inorganic or organic solvent and transferring these solutions into a syringe with a needle tip as a spinneret. The power source is connected to the syringe tip, allowing for the application of a high voltage to the polymer solution, and a metallic collector, often a rotating drum cylinder on which the yielded polymer fibers are deposited. The usual fiber diameters range between nano- and micrometers. The yielded fiber mats have distinct characteristics, such as a large surface area, mechanical stability, and good encapsulation efficiency. Therefore, the fiber mats can be used as a topical dosage form for a multitude of diseases (e.g., conjunctivitis, keratitis), as they can be easily applied on or into the human body to release the drug for a prolonged period of time. In addition, the fibers exhibit a high degree of resemblance with the human extracellular matrix, which consists predominantly of collagen fibrils. Therefore, the obtained fiber mats can also be employed as innovative substrates for the cultivation of cells. As a result, electrospinning is suitable for a wide range of applications in the biomedical context, specifically for the targeted, topical delivery of bioactives and also as a cell culture substrate for the cultivation of cells in an enhanced in vivo relevant situation. One objective of this work was the development and characterization of drug-loaded electrospun fibers for application to the inflamed and infected eye to complement the existing therapy of eye drops as well as systemic administration of anti-infectives. In particular, the focus of the project was the development of ocular implants to treat a herpes simplex infection affecting the human cornea. Additionally, electrospun fibers, which immediately dissolve in the tear fluid upon application and prolong the contact time of the bioactives at the eye, were developed as a topical dosage form to treat bacterial conjunctivitis. An additional objective of this work was the development of electrospun fiber mats as an innovative substrate for the cultivation of human induced pluripotent stem cells to mimic the human blood-brain barrier in vitro. The final objective of the present work was establishing an analytical concept for the comprehensive characterization of electrospun fibers to obtain a greater comparability and reproducibility of data and results from different laboratories. Herpes simplex keratitis is a viral disease of the cornea that can potentially lead to blindness. This disease commonly occurs after corneal transplantation. As the cornea is the most transplanted tissue worldwide, the incidence of this disease varies from 4.9% to 12.6% (high- and low-income countries). The current therapy involves the application of eye drops as many as six times a day, and in severe cases, the systemic use of antiviral agents is necessary but can cause serious side effects (e.g., renal failure). To prevent the occurrence of herpes simplex keratitis after transplantation, a biodegradable electrospun nanofiber mat with a sustained release of acyclovir was established. The rational development of the fibers was facilitated by correlating the surface wettability with the release kinetics of the individual polymers, which allowed for the successful generation of fiber mats releasing the bioactive acyclovir over three weeks. The molecularly dispersed drug is present as an amorphous solid dispersion within the PLGA-based polymer matrix. Evaluating the cell viability in in vitro models proved that neither acyclovir nor the polymers or the generated fiber mats caused any cytotoxicity. The mechanical stability of the fiber mats was evaluated to ensure adequate handling of the fibers during implantation. The findings demonstrated that the fiber mats exhibit direction-independent mechanical properties, and their mechanical load-bearing capacity is greater than that of an excised human cornea. As a result, the fiber mats are suitable for surgical implantation into the anterior chamber of the eye. An in vitro model of human keratinocytes was infected with herpes simplex virus to demonstrate the antiviral efficacy of the electrospun fiber mats. Immunostaining for two specific viral proteins demonstrated the spread of infection in the model. Hereby, it was found that the placebo- and drug-loaded fibers significantly slowed the spread of infection, which was quantified by plaque assay determination. This experiment revealed that the electrospun fibers exert a synergistic antiviral effect by simultaneously releasing acyclovir, which is a virustatic agent that inhibits the replication of the virus in infected cells, and adsorbing released viral particles onto the surface of the polymer fibers. This reduces the overall burden of released viral particles, which is associated with the severity of the infection outbreak. Thus, with the aid of electrospinning, an ocular implant was successfully generated, which is biodegradable over time and significantly reduces the viral particle burden in vitro. Hence, the fibers represent a potential alternative for the prevention of herpes simplex keratitis after corneal transplantation...
• Elektrospinnen ist eine vielseitige und fortschrittliche Herstellungsmethode um polymerbasierte Fasern zu erzeugen. Die Methode hat in den letzten Jahren ein großes Interesse im biomedizinischen Bereich, aufgrund der großen Vielseitigkeit der erzeugten Fasermatten, erweckt. Um diese Fasermatten zu generieren, wird eine in einer Spritze vorliegenden Polymerlösung benötigt, die durch das Anlegen einer Spannung an der Kanüle aus der Spritze auf eine Gegenelektrode geleitet wird. Auf der Gegenelektrode lagern sich die gebildeten Polymerfasern als ein ungewebtes Vlies ab. Die erhaltenen Fasern können Durchmesser von wenigen Nanometern bis zu Mikrometern haben und dabei aus unterschiedlichsten Polymeren bestehen, die biologischer oder (semi-)synthetischer Natur sein können. Dabei weisen die Fasermatten bestimmte Charakteristika, z.B. eine große Oberfläche, mechanische Stabilität und hohe Verkapselungseffizienz, auf. Diese Eigenschaften führen dazu, dass die Fasermatten sehr gut als topische Arzneiform für eine Vielzahl von Erkrankungen (z.B. Konjunktivitis, Keratitis) eingesetzt werden können, um dort den Arzneistoff sehr schnell als auch über einen verlängerten Zeitraum freizusetzen. Zusätzlich weisen die Fasern eine hohe Vergleichbarkeit mit den Kollagenfibrillen der menschlichen extrazellulären Matrix auf. Aus diesem Grund können die erhaltenen Fasermatten auch als Alternativsubstrate für die Kultivierung von Zellen verwendet werden. Daher eignet sich das Elektrospinnen für eine Vielzahl von Fragestellungen in einem breiten biomedizinischen Kontext, im Speziellen für die gezielte, topische Applikation von Arzneistoffen und als Zellkultursubstrat für die Kultivierung von Zellen in einem in vivo relevanteren Kontext. Eines der Ziele dieser Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung von arzneistoffbeladenen, elektrogesponnenen Fasern für die Applikation am entzündeten und infizierten Auge, um die bestehende Therapie aus Augentropfen, Augensalben sowie der systemischen Gabe von Antiinfektiva zu ergänzen. Dabei wurde der Fokus insbesondere auf die Entwicklung von okularen Implantaten zur Behandlung einer Herpes-simplex-Keratitis der menschlichen Kornea gelegt. Des Weiteren wurde mithilfe von elektrogesponnen Fasern, die sich bei der Applikation direkt in der Tränenflüssigkeit auflösen und eine verlängerte Kontaktzeit am Auge erreichen, eine topische Arzneiform für die Behandlung einer bakteriellen Konjunktivitis entwickelt. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von elektrogesponnen Fasermatten als Alternativsubstrat für die Kultivierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, mit dem Ziel, eine humane Blut-Hirn-Schranke in vitro nachzuahmen. Als letztes Ziel der hier vorliegenden Arbeit wurde ein analytisches Konzept für die umfassende Charakterisierung von elektrogesponnen Fasern erarbeitet, um eine bessere Vergleichbarkeit sowie Reproduzierbarkeit von Daten und Ergebnissen unterschiedlicher Labore zu erhalten. Herpes-simplex-Keratitis ist eine virale Erkrankung der Kornea, die potenziell zur Erblindung führen kann. Die Kornea ist das meisttransplantierte Gewebe weltweit und diese Infektion tritt gehäuft nach Korneatransplantationen auf. Daher schwankt die Inzidenz dieser Erkrankung zwischen 4,9 % und 12,6 % (Länder mit hohem und niedrigem Einkommen). Die bisherige Therapie sieht eine bis zu sechsmal tägliche Applikation von Augentropfen vor. Falls dies eine unzureichende Remission der Erkrankung erzielt, ist die systemische Einnahme von antiviralen Wirkstoffen, die schwerwiegende Nebenwirkungen (z.B. Nierenversagen) verursachen können, indiziert. Um das Auftreten einer Herpes-simplex-Keratitis nach einer erfolgten Transplantation zu vermeiden, wurden in der vorliegenden Arbeit bioabbaubare Polymernanofasermatten entwickelt, die den Arzneistoff Aciclovir über einen verlängerten Zeitraum freisetzen und präventiv zur Implantation in der vorderen Augenkammer mit der Kornea vorgesehen sind. Die rationale Entwicklung der Fasern wurde durch eine Korrelation der Oberflächenbenetzbarkeit mit der Freisetzungskinetik der einzelnen Polymere ermöglicht, die dazu führte, dass eine vollständige Freisetzung des Arzneistoffs innerhalb von drei Wochen erfolgreich erzielt werden konnte. Der Arzneistoff liegt dabei als feste Lösung, molekular dispers gelöst, innerhalb der PLGA basierten Polymermatrix vor. Die Evaluation der Zellviabilität von in vitro Modellen zeigte, dass weder Aciclovir noch die verwendeten Polymere oder das fertige Implantat zu einer Schädigung der Zellen führen. Die mechanische Stabilität der Fasermatten wurde positiv evaluiert und zeigte, dass die Fasermatten richtungsunabhängig mechanisch belastbarer als eine Kornea sind. Somit eignen sich die Fasermatten für die chirurgische Implantation in die vordere Augenkammer. Um die antivirale Wirkung der Fasern aufzuzeigen, wurde in diesem Projekt ein in vitro Modell humaner Keratinozyten mit Herpes-simplex-Viren infiziert. Immunfärbungen auf zwei spezifische virale Proteine zeigten die Infektionsausbreitung im Modell deutlich auf. Dabei wurde festgestellt, dass sowohl die Placebo- als auch die arzneistoffbeladenen Fasern den Infektionsfortschritt deutlich verlangsamten, was mithilfe von Plaque-Assays quantifiziert werden konnte. Es stellte sich heraus, dass die elektrogesponnenen Fasern über einen synergistischen antiviralen Effekt verfügen. Dieser Effekt beruht zum einen auf der Freisetzung von Aciclovir, welches als Virustatikum die Vermehrung in den Zellen hemmt, und zum anderen auf der Adsorption von freigesetzten viralen Partikel an der Oberfläche der Polymerfasern. Dies reduziert die insgesamt vorherrschende Last der freigesetzten Viren, die mit der Schwere eines Infektionsausbruchs korreliert. Mithilfe von Elektrospinnen konnte somit erfolgreich ein okulares Implantat generiert werden, welches sich über die Zeit selbst abbaut und signifikant die virale Last in vitro reduzieren konnte. Somit stellen die Fasern eine potenzielle Alternative für die Prävention einer Herpes-simplex-Keratitis nach Korneatransplantation dar...