Open Access

Lisa Kowald

• Post-translational modifications (PTMs) of cell fate regulating proteins determine their stability, localization and function and control the activation of cell protective signaling pathways. Particularly in aberrantly dividing cancer cells the surveillance of cell cycle progression is essential to control tumorigenicity. In a variety of carcinomas, lymphomas and leukemias, the tumor-suppressive functions of the apoptosis- and senescence-regulating promyelocytic leukemia protein (PML) is controlled by numerous PTMs. PML poly-ubiquitylation and polySUMOylation at several lysine (K) residues induce PML degradation that is correlated to a progressive and invasive cancer phenotype. Besides several known E3 ubiquitin protein ligases that are involved in PML degradation, less is known about PML-specific deubiquitylases (DUBs), the respective DUB-controlled ubiquitin conjugation sites and the functional consequences of PML (de)ubiquitylation. Here, we show that the pro-tumorigenic DUB USP22 critically regulates PML protein stability by modifying PML residue K394 in advanced colon carcinoma cells in vitro and that this modification also impacts the homeostasis and function of the leukemia-associated mutant variant PML-RARα. We found that ablation of USP22 decreases PML mono-ubiquitylation and correlates with a prolonged protein half-live in colon carcinoma and acute promyelocytic leukemia (APL) cell lines. Additionally, silencing of USP22 enhances interferon and interferon-stimulated gene (ISG) expression in APL cells in vitro, which together with prolonged PML-RARα stability increases the APL cell sensitivity towards differentiation treatment. In accordance with the novel roles of USP22 as suppressor of the interferon response in human intestinal epithelial cells (hIECs), our findings imply USP22-dependent surveillance of PML-RARα stability and interferon signaling in human leukemia cells, revealing USP22 as central regulator of leukemia pathogenesis.
• Die auf der DNA kodierte Erbgutinformation wird auf den zentralen Ebenen der Epigenetik, der Transkription und der Translation reguliert, wodurch sowohl Diversität als auch Anpassungsfähigkeit eines Organismus‘ hergestellt wird. Zusätzlich steigern weitere Regulationsmechanismen die Variabilität des Erbguts auf ein Vielfaches der vorhandenen Gene. So kann zum Beispiel durch posttranslationale Modifikationen an Proteinen die Konformation, die Stabilität, die zelluläre Lokalisation und somit die Effektorfunktion eines Proteins beeinflusst werden. Neben Acetylierung und Phosphorylierung bildet die Gruppe der Ubiquitylierung und Ubiquitin-ähnlicher Modifizierung einen bedeutenden Teil der posttranslationalen Modifikationen an Proteinen. Ubiquitylierte Proteine spielen je nach Aufbau der konjugierten Ubiquitinkette in unterschiedlichen zellulären Kontexten eine Rolle, wie beispielsweise in proteasomalem Proteinabbau, in der Zellzyklusregulation oder der epigenetischen Markierung. In mehreren Tumorentitäten ist das Zellzyklus-regulierende promyelozytäre Leukämie-protein (PML) phosphoryliert und ubiquityliert, wodurch es zum Abbau dieses Proteins kommt. PML ist ein hauptsächlich nukleär vorkommendes Protein, welches sich unter zellulärem Stress zu Kernkörperchen (nuclear bodies, NB) zusammenlagert und weitere nukleäre Effektormoleküle an sich bindet, um eine schnelle Signalweiterleitung unter Stress-bedingungen zu ermöglichen. Wird PML im Zellkern abgebaut, führt das unter anderem zur Dysregulation der Zellteilung und zur Unterdrückung von Zelltod-Signalwegen, wodurch das Tumorwachstum begünstigt ist. Neben mehreren bekannten Modulatoren des PML-Abbaus, wie beispielsweise E3 Ubiquitin- und E3 SUMO-Ligasen, gibt es wenige Erkenntnisse über PML-spezifische Deubiquitylasen (DUB), die an der Regulation der Proteinstabilität beteiligt sind. In dieser Arbeit beschreiben wir erstmals, dass die PML-Proteinstabilität in Darmkrebszellen teilweise von der pro-tumorigenen Ubiquitin-spezifischen Protease USP22 kontrolliert wird. Wir konnten zeigen, dass die Lysinseitenkette K394 des PML-Proteins in Abhängigkeit von USP22 ubiquityliert wird. In Übereinstimmung mit der bekannten Funktion der ubiquitylierten PML-Aminosäure K394 als PML-Abbausignal, fanden wir heraus, dass eine Mutation der K394-Seitenkette mit einer verlängerten basalen Halbwertszeit des Proteins korreliert. Zusätzlich stellten wir in USP22-defizienten Darmkrebszellen eine Verringerung von basaler PML-Mono-Ubiquitylierung, sowie stress-induzierter PML-SUMOylierung fest. Diese Ergebnisse beschreiben USP22 als negativen Regulator der PML-Proteinstabilität in Darmkrebszellen und bilden eine mögliche Verknüpfung von hohen USP22-Proteinmengen und stark reduzierten PML-Proteinmengen in diversen progressiven Tumorentitäten. Darüber hinaus konnten wir eine K394- und USP22-abhängige Verminderung der Proteinstabilität der Leukämie-assoziierten PML-Mutationsvariante PML-RARα feststellen. PML-RARα ist ein onkogener nukleärer Rezeptor, der durch gesteigerte transkriptionelle Repression die Ausdifferenzierung von myelozytären Vorläuferzellen unterdrückt und somit die Entstehung der akuten promyelozytären Leukämie (APL) verursacht. In USP22-depletierten APL-Zellen konnten wir neben einer verlängerten Halbwertszeit des PML-RARα Fusionsrezeptors auch eine USP22-abhängige, partielle Unterdrückung des PML-RARα-Abbaus in APL-Zellen beobachten, die mit dem Differenzierungsagenz all-trans Retinolsäure (ATRA) behandelt wurden. ATRA wird in der derzeitigen APL-Therapie eingesetzt, um einerseits die transkriptionelle Repression von Differenzierungsgenen aufzuheben und andererseits, um den Fusionsrezeptor PML-RARα abzubauen. Erstaunlicherweise konnten wir zusätzlich zur Stabilitätssteigerung von PML-RARα eine signifikante Erhöhung der ausdifferenzierten Myelozyten-Population in ATRA-behandelten, USP22-defizienten APL-Zellen feststellen. Die Zunahme dieser CD11b-positiven Population erfolgte bereits nach Inkubation mit subklinischen ATRA-Konzentrationen und weist somit auf eine grundlegend sensitivierende Wirkung des USP22-Verlusts auf APL-Zellen hin. Interessanterweise stellten wir in unbehandelten APL-Zellen eine USP22-kontrollierte Unterdrückung von Interferonen und Interferon-stimulierten Genen fest. Dieses Ergebnis korreliert mit der bekannten, ATRA-induzierten Hochregulation von Interferon-Signalwegen während der Ausdifferenzierung von Leukämiezellen und begründet somit möglicherweise die gesteigerte Sensitivität von USP22-defizienten APL-Zellen gegenüber ATRA-vermittelter Differenzierung. In Übereinstimmung mit der vor Kurzem identifizierten Rolle von USP22 als Suppressor der Interferon-Antwort in menschlichen Darmepithelzellen, deuten unsere Ergebnisse auf eine neue Funktion von USP22 als Regulator von Interferon-Signalwegen in menschlichen Leukämiezellen hin...