Sequencing and functional analysis of CYP2C promoter isolated from porcine coronary artery endothelial cells

  • Cytochrome P450 (CYP) enzymes oxidize, peroxidize and/or reduce cholesterol, vitamins, steroids, xenobiotics and numerous pharmacological substances in an oxygen- and NADPHdependent manner. Since many CYP isozymes are also capable of metabolizing arachidonic acid to biologically active products, CYP enzymes are often described as the third pathway of arachidonic acid metabolism i.e., in addition to cyclooxygenases and lipoxygenases. CYP enzymes are predominantly expressed in the liver while others, such as members of the CYP 2J, CYP 2C and CYP 4A subfamilies, can be detected in extrahepatic tissues, particularly in the cardiovascular system. Recent data suggest that a CYP 2C enzyme(s) expressed in coronary artery endothelial cells generate epoxyeicosatrienoic acids (5,6-; 8,9-; 11,12- and 14,15-EET) which contribute to the acute control of vascular tone and the longterm regulation of vascular homeostasis. The expression of CYP 2C in coronary artery endothelial cells is regulated by a number of stimuli, such as cyclic stretch and fluid shear stress as well as by the corticosteroid cortisol and a number of CYP substrates (nifedipine, cerivastatin and -naphthoflavone). However, the signalling pathways and the transcription factors involved in regulating the expression of the gene are unknown. Since most of the CYP 2C enzymes are transcriptionally regulated, we were interested in identifying the CYP 2C isoform(s) expressed in porcine coronary artery endothelial cells (PCAEC) as well as determining its/their promoter sequence(s). The overall goal was to study the involvement of different transcription factor binding elements in the regulation of the CYP 2C gene(s). Porcine coronary arteries were used given the possibility of analysing the results obtained at the cellular level with alterations in vascular function. Comparison of the porcine CYP 2C and the human CYP 2C8 and 2C9 promoters was also a major goal of this study. To identify the relevant porcine CYP 2C isoform nested RT-PCR was performed using total RNA from porcine coronary artery endothelial cells. Comparison of the sequence of the product of this reaction with the NCBI database suggested that the CYP 2C expressed in PCAEC was approximately 85% homologous with the human CYP 2C9 enzyme. To obtain the full length CYP 2C isoform 5´ rapid amplification of cDNA end (5´ RACE) was performed using a downstream reverse gene specific primer which is conserved in all of the porcine CYP 2C isoforms. The intention behind using such a primer was to amplify all the possible CYP cDNAs expressed in PCAEC. With the 5´ RACE technology it was possible not only to identify the exact isoform (CYP 2C34) expressed in PCAEC, but it was also possible to amplify 550 bp of the 5´ upstream region. This result was authenticated by comparing the protein/nucleotide sequence with other human CYP 2C genes such as CYP 2C8 and CYP 2C9 as well as different porcine CYP 2C genes (CYP 2C34, CYP 2C49). Multiple protein/nucleotide sequence alignment revealed approximately 85-90% sequence identity. An exon1-2 specific radio-labelled probe of the CYP 2C34 gene was then used to screen a porcine genomic library for positive genomic clones containing the promoter region of the CYP 2C34 gene. For the isolation of 5´ flanking region of CYP 2C34 gene a PCR-based directional genome walking strategy was used in which the positive porcine genomic BAC clones were taken as a DNA template. Four arbitrarily designed universal walking primers and a gene-specific primer derived from the CYP 2C34 gene sequence were employed and led to the identification and isolation of 1.4 kb of the 5´ flanking region. The 1.4 kb 5´ flanking region of CYP 2C34 gene contains multiple transcription factor binding sites including glucocorticoid-responsive element (GRE), hypoxia-responsive element (HRE), CAAT-enhancer binding protein (C/EBP), stress responsive element (STRE) consensus sequences. CYP 2C34 promoter constructs were generated and reporter gene activity (luciferase) activity was compared with that of a promoterless vector (pGL3-Basic) at first in HEK cells and then in PCAEC. After using cortisol as a positive control to demonstrate that the promoter constructs generated were functional we determined the effects of physiologically relevant stimuli i.e., hypoxia and cyclic stretch. Additional experiments with zinc sulphate were performed in a preliminary analysis of the role of Zn2+ inducible transcription factors and might be cooperative heterodimerization formation with these transcription factor with C/EBP in the regulation of CYP 2C34 expression. With all these stimuli, reporter gene activity of CYP 2C34 promoter was significantly (3-8 fold) increased over values obtained in unstimulated cells. Analysis of the regions that are essential for the induction of promoter activity in response to the different stimuli of interest have to be performed in combination with gel shift assays, siRNA experiments as well as site-directed mutagenesis experiments. Comparison of the regulation of the CYP 2C34 gene and correlation with changes in vascular function (in isolated porcine coronary arteries) should deliver information relevant to the regulation of the CYP 2C enzyme expressed in human coronary artery endothelial cells. The recent demonstration of a clinically relevant role for CYP 2C9 in coronary heart disease underlines the importance of such a study.
  • Die Superfamilie der Cytochrom P450 (CYP) Enzyme ist vor allem am Abbau von Gift- und Arzneistoffen sowie an der Biosynthese von Steroidhormonen beteiligt. In der Leber machen diese Enzyme 20% des Gesamtproteins aus. Zu den von CYP Enzymen katalysierten Reaktionen zählen Demethylierungen, Aromatisierungen, Hydroxylierungen, Oxygenierungen und Epoxygenierungen. Im Verlauf der letzten Jahre ist die Expression für viele CYP Isoformen auch in extrahepatischem Gewebe beschrieben worden. In humanen vaskulären Zellen konnte mittels RT-PCR die Expression der Isoformen CYP 1A1, CYP 2C8, CYP 2J2, CYP 3A4 und CYP 4A3 nachgewiesen werden, wobei im vaskulären System bisher nur eine Funktion für CYP 4A, CYP 2C und CYP 2J eindeutig nachgewiesen wurde. Als Substrat nutzen diese Isoformen vor allem Arachidonsäure und sie sind somit, neben der Cyclooxygenase und der Lipoxygenase, maßgeblich an deren Metabolisierung beteiligt. Während CYP 4A dieses Substrat durch eine -Hydroxylierung in 20-Hydroxyeicosatetraensäure (20-HETE) umwandelt, das auf arterielle Gefäße stark kontrahierend wirkt, epoxygenieren CYP 2C und CYP 2J Enzyme Arachidonsäure zu den vier Regioisomeren der Epoxyeicosatriensäure (5,6-, 8,9-, 11,12- und 14,15 EETs). Eine Konsequenz der im Endothel gebildeten EETs ist die Aktivierung von Calcium-abhängigen Kaliumkanälen, was eine Hyperpolarisation dieser Zellen zur Folge hat. Diese endotheliale Hyperpolarisation wird entweder über myo-endotheliale Gap Junctions oder über Botenstoffe auf die glatte Gefäßmuskulatur übertragen, so dass es durch eine Verminderung der Öffnungswahrscheinlichkeit der spannungsabhängigen Calciumkanäle zur Abnahme des intrazellulären Calciums und damit zur Relaxation des Gefäßes kommt. Diese Relaxation ist unabhängig von Stickstoffmonoxid und Prostazyklin, und aufgrund der endothelialen Bildung und der mit der Relaxation einhergehenden Hyperpolarisation gehören EETs zu den endothelialen hyperpolarisierenden Faktoren (EDHFs). In Endothelzellen von Schweinekoronararterien konnte durch die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden eindeutig gezeigt werden, dass ein CYP 2C Enzym (EDHF-Synthase), welches stark homolog zu den menschlichen Isoformen CYP 2C8 und 2C9 ist, maßgeblich an der Bildung von EETs und den EDHF-vermittelten Gefäßantworten beteiligt ist. Von EETs wurden aber auch anti-inflammatorische, anti-thrombotische und - bezüglich glatter Gefäßmuskelzellen - auch anti-proliferative Wirkungen berichtet. In humanen Endothelzellen konnte gezeigt werden, dass sowohl die Applikation von EETs wie auch die CYP 2C9 Überexpression eine Steigerung der Aktivitäten verschiedener Kinasen (Erk 1/2, Proteinkinase B, p38-MAP Kinase und Tyrosinkinasen) zur Folge hat. Diese EET-vermittelten Effekte sind an der Proliferation und Migration von Endothelzellen sowie an der Angiogenese entscheidend beteiligt. Die pro-angiogene Wirkung von EETs konnte durch die Hemmung der Tyrosinkinase des „epidermal growth factor“ Rezeptors (EGF-Rezeptor) vollständig gehemmt werden. Eine Steigerung der Expression von endogenen CYP 2C Enzymen in Endothelzellen kann durch mechanische Stimulation der Zellen, wie rhythmische Dehnung und Schubspannung, oder auch durch pharmakologische Stimulation mit Statinen, Cortisol oder Calciumantagonisten wie Nifedipin erreicht werden. Die Studien des Effektes einer vermehrten CYP 2C Expression auf das Membranpotential von vaskulären Zellen und den Gefäßtonus der Arterien sind vor allem an Schweinekoronararterien durchgeführt worden, wobei bisher allerdings nicht bekannt ist, welche CYP 2C Isoform in den Endothelzellen dieser Gefäße exprimiert ist. Um weitere funktionelle Konsequenzen von CYP 2C in intakten Koronararterien zu untersuchen, ist es notwendig entweder die EDHF-Synthase spezifisch zu hemmen oder die Expression durch pharmakologische oder physiologische Stimuli spezifisch zu induzieren. Die Voraussetzung hierfür wiederum ist die Identifizierung der CYP 2C Isoform in Endothelzellen der Schweinekoronatarterie. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte daher zunächst geklärt werden, welche CYP 2C Isoform in Schweinekoronararterien exprimiert ist. Im Anschluss daran sollte die nicht-transkribierten 5´ regulatorischen Sequenzbereiche des Gens charakterisiert werden. Zu Beginn der Arbeit waren in der NCBI Datenbank nur 5 Teilsequenzen (ca. jeweils 650 bp im Bereich von Exon 4 bis 8) von CYP 2C Isoformen des Schweins veröffentlicht, deren DNA-Sequenzhomologie untereinander bei 96 bis 98% liegt, sowie eine Sequenz mit der gesamten kodierenden Sequenz des in der Leber exprimierten CYP 2C49. Aufgrund der hohen Homologie der CYP 2C Sequenzen konnte zur Amplifikation der endothelial exprimierten CYP 2C Sequenzen ein PCR Ansatz genutzt werden, bei welchem durch die Verwendung einer Kombination von einem unspezifischen äußeren Primerpaar und einem spezifischeren inneren Primerpaar („nested PCR“) alle exprimierten CYP 2C Enzyme in der RNA aus Endothelzellen der Schweinekoronararterien amplifiziert werden. Die Fragmente wurden kloniert und deren Sequenz mit den in der Datenbank verfügbaren cDNA Sequenzen verglichen. Das Produkt zeigte auf Nukleinsäureebene 97% Identität zu CYP 2C32 und 96% zu CYP 2C34. Um die 5´ nichtkodierenden Sequenzbereiche von CYP 2C32 bzw. CYP 2C34 zu charakterisieren, wurde eine genomische DNA Bank des Schweins, kloniert in bakterielle artifizielle Chromosomen (BAC), mit den CYP 2C spezifischen Sonden aus dem Exonbereich 4 bis 8 hybridisiert. Von den 16 positiven Klonen wurden Restriktionsfragmente subkloniert, jedoch waren alle CYP 2C spezifischen Sequenzen aus dem Bereich von Exon 4 bis 8 und damit, in Anbetracht von vielleicht sehr langen Intronabschnitten, sehr weit von den transkriptionsregulatorischen 5´ nichtkodierenden Sequenzen entfernt. Die Hybridisierung der genomischen DNA Bibliothek mit einer Sonde aus dem 5´ Ende der cDNA von CYP 2C9 ergab kein positives Hybridisierungssignal. Um eine für die Hybridisierung geeignetere DNA Sonde aus dem 5´ Bereich von CYP 2C34 oder 2C32 zu erhalten und gleichzeitig die in Schweineendothelzellen exprimierte CYP Isoform zu verifizieren, wurde ein 5´ RACE („rapid amplification of cDNA ends“) Experiment durchgeführt. Bei dieser Methode dient ein Oligonukleotid, dessen komplementäre Sequenz an das 5´ Ende der mRNA während der cDNA Synthese ligiert wird, zusammen mit einem genspezifischen Primer, dessen Sequenz aus der 5´ kodierenden Region der cDNA abgeleitet wird, als Primerpaar für eine PCR. Aus zwei voneinander unabhängigen Zellpräparationen kultivierter Schweinekoronarendothelzellen konnten CYP 2C spezifische Amplifikationsprodukte kloniert werden. Die Identität dieser Klone war in beiden RNA Präparationen gleich. Die Sequenzierung der Klone ergab, dass 8 der isolierten Klone die cDNA von CYP 2C34 enthielten und 2 ein Pseudogen von CYP 2C42 enthielten, wobei letzteres für die weitere Studie nicht herangezogen wurde. Mit einer DNA Sonde aus dem 5’ Bereich der kodierenden Sequenz von CYP 2C34 wurde die genomische DNA Bank in den BACs nochmals hybridisiert und 19 positive Klone identifiziert. Anstelle einer Subklonierung von Restriktionsfragmenten wurde nun zur Identifizierung und Klonierung des 5’ nichtkodierenden Bereichs eine PCR Strategie angewandt („directional genome walking“), bei der ein genspezifischer „reverse“ Primer in Kombination mit sehr unspezifischen „forward“ Primern ein PCR Produkt ergeben soll, das neben den bekannten kodierenden Sequenzen auch den unbekannten nicht kodierenden Bereich enthält. Diese Strategie wurde mit 7 der Klone, die mit der 5´ Sonde von CYP 2C34 positiv waren, durchgeführt. Nach Hybridisierung der PCR Produkte mit der Sonde aus dem 5´ Bereich der cDNA Sequenz von CYP 2C34 konnte aus zwei Klonen ein Hybridisierungssignal erhalten werden. Nach der Klonierung und Sequenzierung der PCR Produkte zeigte sich, dass einer der genomischen Klone die 5´ nichttranslatierte Region von CYP 2C34, der andere die 5´ nichttranslatierte Region von CYP 2C49 enthielt. Um einen längeren Bereich der Promotorregionen zu erhalten wurde das „directional genome walking“ noch zweimal mit den genomischen Klonen als Matrix durchgeführt, wobei die Nukleotidsequenz des genspezifischen „reverse“ Primers aus der Sequenzinformation der PCR-Fragmente abgeleitet wurde. Daraus ergab sich eine DNA Sequenz die 1.4 kb der 5´ nichttranslatierten Region von CYP 2C34 enthielt. Für die Klonierung des kompletten Bereichs der 5´ nichtkodierenden Region von CYP 2C34 in einem Fragment wurden aus der Sequenzinformation der Produkte des „directional genome walking“ nochmals PCR Primer abgeleitet und für eine Amplifikation mit dem entsprechenden genomischen Klon als Matrix verwendet. Das Amplifikationsprodukt wurde wiederum kloniert und sequenziert. Dieses 1.4 kb große CYP 2C34 Promotorfragment wurde in einen Luciferase-Reportergenvektor kloniert um Promotoranalysen durchzuführen. Die Analyse der Sequenz ergab einige Bindungsstellen für den Glucocorticoidrezeptor, des CAAT-Enhancer Bindungsproteins und einiger Zinkfingertranskriptionsfaktoren, sowie Sequenzen die für die Regulation der Transkription durch Hypoxie oder mechanischen Stress von Bedeutung sind. Um einen direkten Vergleich der Promotoraktivität von CYP 2C34 mit anderen CYP Promotoren zu haben, wurden parallel die Promotoren von CYP 2C8 und 2C9 kloniert. Hierfür wurde menschliche genomische DNA (CYP 2C8) bzw. ein schon in einem Klonierungsvektor vorhandenes Fragment (CYP 2C9) für eine PCR verwendet. Die resultierenden Produkte wurden ebenfalls in den Luciferase-Reportergenvektor kloniert. Der CYP 2C8 Promotor zeigte in diversen Zellinien weder basal noch nach Behandlung mit CYP-induzierenden Substanzen eine messbare Aktivität. Die Analyse der Sequenz des CYP 2C8 Promotors zeigte, dass sich eine invertierte Duplikation einer 60 bp langen Nukleinsäuresequenz als auch eine Inversion eines ungefähr 170 bp langen DNA Stückes in dem mittels PCR amplifizierten und klonierten DNA Fragment befand. Diese Abweichungen könnten die fehlende Promotoraktivität begründen. Im Weiteren wurde deshalb nur noch der CYP 2C9 und der CYP 2C34 Promotor untersucht. Zur Analyse dieser Promotoraktivitäten wurden entweder transfizierte Endothelzellen aus Schweinekoronararterien oder humane Nierenepithelzellen (HEK 293) verwendet. Die Zellen wurden kotransfiziert mit einem Vektor, der die ß-Galactosidase unter der Kontrolle des Cytomegalievirus-Promotors exprimiert, um Unterschiede in der Transfektionseffizienz abgleichen zu können. Zur Bestätigung der Funktionalität der klonierten Promotoren wurde zunächst die Steigerung der Luciferaseaktivität durch die Inkubation der Zellen mit Glucocorticoiden bestimmt. Sowohl für den CYP 2C9 als auch für den CYP 2C34 Promotor konnte ein 6-7 facher Anstieg der Promotoraktivität beobachtet werden. Im Anschluß daran wurde die Aktivität des CYP 2C34 Promotors in den Zellen unter verschiedenen Bedingungen bestimmt. Hierbei wurden Stimuli eingesetzt, von denen beschrieben ist, dass sie die Expression von CYP 2C in Endothelzellen von Schweinekoronararterien erhöhen. So konnte eine 3-4 fache Steigerung der CYP 2C34 Promotoraktivität durch rhythmische Dehnung als auch durch Hypoxie gefunden werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die in Schweinekoronarendothelzellen exprimierte CYP 2C Isoform CYP 2C34 ist. Ein 1.4 kb langes DNA Fragment aus der 5´ nichtkodierenden Region des Gens vermittelt die transkriptionelle Expressionssteigerung durch Cortisol, rhythmische Dehnung und hypoxische Bedingungen in Endothelzellen aus der Schweinekoronararterie. Die funktionelle Klonierung des CYP 2C34 Promotors ermöglicht eine einfache Identifizierung von expressionssteigerenden physiologischen oder pharmakologischen Stimuli. Solche spezifischen CYP 2C34 Induktoren bilden die Grundlage der Untersuchung der Relevanz einer vermehrten CYP 2C34 (EDHF-Synthase) Expression in Endothelzellen in vivo sowie in isolierten Gefäßen.

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Metadaten
Author:Pravir KumarORCiD
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-843240
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Beate FißlthalerORCiD, Ingrid FlemingORCiDGND
Advisor:Beate Fißlthaler
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2004
Year of first Publication:2004
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Release Date:2024/05/03
Page Number:125
HeBIS-PPN:51933003X
Institutes:Biowissenschaften / Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
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