Open Access

Daniela Baus

• Hodgkin-Lymphom-Biopsien und abgeleitete Zelllinien sind charakterisiert durch die konstitutive Aktivität verschiedener Komponenten des JAK/STAT-Signalweges. Dennoch ist die Bedeutung dieser Signalvermittler für die Pathogenese des klassischen Hodgkin-Lymphoms nicht vollständig geklärt. Gegenstand dieser Arbeit war die Bedeutung der JAK/STAT-Signalkaskade, sowie insbesondere die zellulären Funktionen von STAT3 und STAT6 zu untersuchen. Zu diesem Zweck kamen zwei verschiedene synthetische Kinase-Inhibitoren (AG490, Cucurbitacin I) zum Einsatz. Beide Substanzen blockieren die Kaskade auf Ebene der Kinasen und sind als JAK2/STAT3-spezifische Inhibitoren beschrieben. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit beiden Substanzen das Wachstum der malignen Zellen hemmte. Gelretardierungsexperimente ergaben jedoch, dass beide Inhibitoren in allen HL-Zelllinien immer mehr als nur ein STAT-Molekül hemmten. Somit konnte keine Aussage über die Bedeutung einzelner STATs getroffen werden. Um die zellulären Funktionen von STAT3 und STAT6 zu untersuchen wurden daher spezifische siRNAs mittels lentiviraler Vektoren exprimiert. Die Rolle von STAT3 bei der Entstehung verschiedenster Krebsarten ist bereits gut charakterisiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass STAT3 auch in HL-Zellen ein wichtiger Regulator von Proliferation und Apoptose ist. Darüber hinaus konnte auch STAT6 als Vermittler proliferations-fördernder, anti-apoptotischer Signale identifiziert werden. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine alleinige Hemmung von STAT6 ausreicht um Apoptose in einigen HL-Zellen auszulösen. Diese Induktion von Apoptose wurde durch Caspasen vermittelt. Um den genauen Mechanismus aufzuklären und um STAT6-Zielgene zu identifizieren, die anti-apoptotisch wirken, wurde eine Microarray-Analyse durchgeführt. Eine weitere Möglichkeit die Aktivierung der JAK/STAT-Signalkaskade zu beeinflussen bieten die SOCS-Proteine. Diese sind direkte Zielgene der STATs und regulieren die Signalvermittlung in einer negativen Rückkopplung. In vielen unterschiedlichen Krebsarten ist diese Negativregulation ausgefallen oder fehlerhaft. Das kann zu einer konstitutiven Aktivierung des JAK/STAT-Signalweges beitragen. Die Bedeutung der SOCS-Proteine im klassischen Hodgkin-Lymphom ist noch unbekannt und wurde in dieser Arbeit untersucht. Es wurden unterschiedliche Mengen endogenes SOCS1 und SOCS3 in verschiedenen HL-Zelllinien und in HL-Biopsien detektiert. In Überexpessionsexperimenten mit SOCS1 und SOCS3 konnte gezeigt werden, dass sowohl SOCS1, als auch SOCS3 nur in Zellen, die wenig endogene SOCS besitzen, die Aktivität von STAT3 und STAT6 inhibieren konnten. Die Überexpression resultierte in einem Wachstumsarrest und einem erhöhten Anteil toter Zellen. In Zellen, die bereits viel SOCS besaßen, konnten weder STAT3 noch STAT6 inhibiert werden. In diesem Zusammenhang wurde ein Modell, das potentielle Möglichkeiten zum Umgehen einer Negativregulation durch die SOCS-Proteine darstellt, diskutiert. Darüber hinaus konnte in Gelretardierungsexperimenten gezeigt werden, dass SOCS3 zusätzlich zu STAT3 und STAT6 in Zellen, die wenig SOCS besaßen, auch NF?B-Aktivierung hemmte. Da NF?B bereits als wichtiger Überlebensfaktor für HL-Zellen beschrieben wurde, trägt dessen Inhibition wahrscheinlich zu einer Hemmung des Wachstums bei. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit STAT3 und STAT6 als potentielle Ziele für therapeutische Ansätze für das klassische Hodgkin-Lymphom identifiziert werden. Einen weiteren Angriffspunkt für zukünftige Strategien liefern die SOCS-Proteine, die eine signalweg-übergreifende Hemmung von Transkritionsfaktoren erlauben.
• Classical Hodgkin lymphoma biopsies and derived cell lines are characterized by constitutive activation of several components of the JAK/STAT signalling pathway. Nevertheless, the significance of distinct JAK/STAT components for the pathogenesis of classical Hodgkin lymphoma is poorly understood. The aim of this work was the investigation of the cellular function of distinct JAK/STAT members, especially STAT3 and STAT6. For this purpose two different JAK kinase inhibitors (AG490, Cucurbitacin I) were used. Both substances act on the level of kinases and are reported to specifically inhibit JAK2/STAT3 mediated signals. Incubation of several lymphoma derived cell lines with these inhibitors decreased proliferation of the malignant cells and increased to number of dead cells significantly. However, gelretardation assays and western blot analysis revealed that both substances blocked the activation of several STAT family members. Therefore it was not possible to distinguish between effects mediated by STAT3 alone. To allow a specific inhibition of STAT3 and STAT6, siRNAs were designed and expressed via lentiviral vectors. The role of STAT3 in the pathogenesis of several malignancies is already well established. This work could show that STAT3 also plays an important role in the regulation of proliferation and apoptosis in classical Hodgkin lymphoma cells. Moreover, I could identify STAT6 as a mediator of proliferative and anti-apoptotic signals. siRNA experiments revealed for the first time, that the inhibition of STAT6 alone is sufficient to induce apoptosis in some lymphoma cell lines. To examine the mechanism of apoptosis induction in more detail and to identify STAT6 target genes a microarray analysis was performed. Another possibility to inhibit the JAK/STAT signalling cascade provide negative regulators of the pathway such as the suppressor of signalling (SOCS) proteins. SOCS proteins, especially SOCS1 and SOCS3 are direct target genes of the STATs. In various malignancies the expression of SOCS1 and SOCS3 is disturbed resulting in constitutive activation of the signalling cascade. The significance of the SOCS proteins in the development of classical Hodgkin lymphoma is unknown and was part of this work. Analysis of biopsies and cell lines revealed different expression patterns of SOCS1 and SOCS3. Overexpression of both SOCS in cell lines, which contain low amounts of endogenous SOCS1 and SOCS3, inhibited the activation of STAT3 and STAT6. This inhibition resulted in decreased proliferation and increased cell death. In cells, which already contain high amounts of SOCS1 and SOCS3, overexpression of both negative regulators had no effect on STAT activation and cellular functions. Additionally, gelretardation assays revealed that SOCS3 blocked the activation of the transcription factor NF?B. This inhibition most probably contributes to the induction of cell death. In summary, this work identified STAT3 and STAT6 as important regulators of proliferation and apoptosis in classical Hodgkin lymphomas. Furthermore, the significance of SOCS1 and SOCS3 for cellular functions was investigated. Altogether these findings may provide potential for future therapeutic approaches.