Open Access

Christina Malicek

• Onkogene RAS-Mutationen zählen mit einem Vorkommen von ca. 25% zu häufigen Genmutationen in malignen Tumoren. Auch im Rhabdomyosarkom (RMS), dem häufigsten Weichteilsarkom im Kindesalter, findet sich eine hohe Rate an wiederkehrenden RAS-Signalwegmutationen. Dabei scheint ein Zusammenhang zwischen der RMS-Risikostratifizierung und dem Vorkommen von RAS-Mutationen zu bestehen. Da Hochrisiko-RMS im Vergleich zu anderen Tumorentitäten im Kindesalter immer noch mit einer unterdurchschnittlichen Prognose einhergehen, stellen RAS-Mutationen einen interessanten Angriffspunkt für eine zielgerichtete Tumortherapie dar. Hierzu soll diese Arbeit durch eine genauere Charakterisierung der Auswirkungen onkogener RAS-Gene auf das RMS beitragen. Verwendet wurden genetisch modifizierte RMS13 Zellen mit ektoper Expression der onkogenen RAS-Mutationen HRAS12V, KRAS12V oder NRAS12V. Eine bereits gut beschriebene Eigenschaft von RAS ist die Förderung der Zellproliferation. Daneben wurde auch beschrieben, dass RAS Einfluss auf den programmierten Zelltod nehmen und in Abhängigkeit vom zellulären Kontext pro- oder auch antiapoptotisch wirken kann. Daher stellte sich die Frage, welche Auswirkungen onkogene RAS-Mutationen in diesem Kontext auf Rhabdomy-osarkomzellen haben. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die ektope Expression von HRAS12V, KRAS12V oder NRAS12V in RMS13 Zellen zu einer gesteigerten Zellproliferation führt, im Hinblick auf die spontane Zelltodrate jedoch keine Veränderungen bewirkt. Damit stellt die erhöhte Proliferationsrate RAS-mutierter Rhabdomyosarkome einen wichtigen Unterschied zu entsprechenden Tumoren ohne solche Mutationen dar. Chemotherapeutika wie Etoposid und Doxorubicin, die besonders effektiv gegen hochproliferierende Zellen sind, zeigen jedoch keinen signifikanten Unterschied in ihrer Wirksamkeit gegen RMS13 Zellen in Anwesenheit von onkogenem RAS. Damit scheint ein selektives Eingreifen in die proliferationsfördernden Mechanismen nötig zu sein, um RAS-mutierte Zellen gezielt in ihrem Wachstum zu hemmen. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit, spezifischer, gezielter Tumortherapien. Neben dem Einfluss auf das Zellwachstum wurden auch Veränderungen in der Redoxhomöostase untersucht. Bisherige indirekte Hinweise auf einen erhöhten oxidativen Stress im RMS in Anwesenheit von RAS-Mutationen können in dieser Arbeit durch den direkten Nachweis erhöhter ROS-Level in RAS-mutierten RMS13 Zellen bestätigt werden. Die akzelerierte ROS-Konzentration lässt vermuten, dass das Überleben von RMS-Zellen mit konstitutiver RAS-Aktivierung in besonderem Maße von antioxidativen Zellstrukturen abhängig sein könnte. Dies könnte sie sensibler gegenüber exogenen Stimuli machen, die zu einer weiteren Erhöhung des oxidativen Stresses führen. Als hervorzuhebendes Ergebnis zeigt diese Arbeit jedoch, dass die ektope Expression von HRAS12V, KRAS12V oder NRAS12V in RMS13 Zellen vor einem oxidativen Zelltod schützt. In Anwesenheit der RAS-Mutationen zeigen RMS13 Zellen einen signifikant geringeren Zellviabilitätsverlust gegenüber einem Eingriff in verschiedene Komponenten des antioxidativen Systems wie durch RSL3 (Glutathion-Peroxidase 4 Inhibitor), Erastin (indirekter Inhibitor der Glutathion-Synthese) oder Auranofin (Thioredoxin-Reduktase-Inhibitor). Dies steht im Gegensatz zu den Erstbeschreibungen, in denen für RSL3 und Erastin eine RAS-selektive Wirkung gezeigt wurde. Als Besonderheit kann der durch RSL3 oder Erastin hervorgerufene Zelltod der RMS13 Zellen als Ferroptose identifiziert werden. Hierbei handelt es sich um eine vor kurzem neu beschriebene Form von programmiertem, oxidativem und eisenabhängigem Zelltod. Diese Arbeit verdeutlicht somit, dass onkogene RAS-Mutationen im RMS gezielt in die Redoxregulation eingreifen, jedoch nur in bestimmten zellulären Kontexten für oxidative Stressoren zu sensibilisieren scheinen. Daneben weist diese Arbeit auch einen protektiven Effekt von onkogenem RAS gegenüber dem dualen PI3K/mTOR-Inhibitor PI-103 in RMS13 Zellen nach. Zusammengenommen deutet dies darauf hin, dass RAS selektiv Einfluss auf durch zytotoxische Stimuli hervorgerufenen Zelltod nimmt. Die Ergebnisse dieser Arbeit, insbesondere der Nachweis einer erhöhten Resistenz gegenüber oxidativen Stressoren in Anwesenheit onkogener RAS-Gene, leisten einen wichtigen Beitrag zur Entwicklung neuer zielgerichteter und selektiver RMS-Therapiestrategien.
• With a prevalence of 25%, oncogenic RAS mutations are very common in malignant tumors. Studies also detected a high rate of recurrent mutations in the RAS pathway in rhabdomyosarcoma (RMS), the most common soft tissue tumor in childhood. Additionally, there seems to be a correlation between RMS risk stratification and the presence of RAS mutations. Since high-risk RMS is still associated with a below-average prognosis compared to other tumor entities in childhood, RAS mutations may represent an interesting target for new treatment strategies. To this end, this thesis investigates the role of oncogenic RAS proteins and their impact on cellular functions in RMS. Engineered RMS13 cells with ectopic expression of the oncogenic mutations HRAS12V, KRAS12V or NRAS12V were used for the following investigations. A well described characteristic of RAS proteins is the promotion of cell proliferation. Further, it has recently been reported that RAS proteins also influence programmed cell death and can have a pro- or antiapoptotic effect depending on the cellular context. This thesis demonstrates that the ectopic expression of RAS mutations in RMS13 cells leads to an increase in cell proliferation but does not affect the rate of spontaneous cell death. Thus, the rise in cellular proliferation constitutes an important difference between RAS-mutated RMS and corresponding tumors without RAS mutations. However, oncogenic RAS does not affect the sensitivity of RMS13 cells towards chemotherapeutics such as etoposide or doxorubicin, although those agents are particularly effective against highly proliferative cells. Consequently, selective intervention in proliferation-promoting mechanisms seems to be necessary in order to selectively inhibit the growth of RAS-mutated cells. This highlights the need for specific, targeted therapies. Apart from promoting cell growth and proliferation, RAS proteins have also been implicated to cause alter-ations in redox homeostasis of cells. This thesis confirms previously reported, indirect evidence for increased oxidative stress in RMS in the presence of RAS mutations by directly detecting elevated ROS levels in RAS-mutated RMS13 cells. The accelerated ROS concentration suggests that survival of RMS cells with constitutive RAS activation might be highly dependent on antioxidant cell structures. This might render them more sensitive to exogenous stimuli that lead to a further increase in oxidative stress. As a key finding, this thesis demon-strates that the ectopic expression of oncogenic HRAS12V, KRAS12V or NRAS12V prevents oxidative cell death in RMS13 cells. In the presence of RAS mutations, the RMS13 cells exhibit a significantly lower loss of cell viability than after interfering in various components of the antioxidant system with RSL3 (glutathione peroxidase 4 inhibitor), erastin (indirect inhibitor of glutathione synthesis) or auranofin (thioredoxin reductase inhibitor). Interest-ingly, RSL3 and erastin were initially described as substances with RAS-selective lethality. As a special feature, cell death triggered by RSL3 or erastin in RMS13 cells is shown to be ferroptosis, a recently described form of pro-grammed oxidative, iron-dependent cell death. Taken together, this thesis demonstrates that oncogenic RAS mutations interfere in redox regulation and oxidative cell death mechanisms in RMS, but only appear to sensitize to oxida-tive stressors in certain cellular contexts. Moreover, oncogenic RAS also leads to a higher resistance in RMS13 cells to cell death triggered by the dual PI3K / mTOR inhibitor PI-103. This suggests that RAS proteins in RMS13 cells selectively modulate cell death pathways triggered by cytotoxic stimuli. The findings of this thesis, especially the demonstration of increased resistance to oxidative stimuli by oncogenic RAS proteins, provide an important contribution to the de-velopment of new targeted and selective therapeutic strategies in rhabdomyo-sarcoma.