Open Access

Christian Landgraf

• Die Atherosklerose stellt eine der Haupttodesursachen der westlichen Zivilisation dar. Die Karotisbifurkation ist eine der Lokalisationsorte für die Formierung einer atherosklerotischen Läsion, die sich nach Lumeneinengung schliesslich in neurologischen Symptomen bemerkbar machen kann. In einer fortgeschrittenen, symptomatisch gewordenen Karotisplaque kann als charakteristisches Merkmal oftmals ein in der Literatur unter dem Begriff der „Ruptur“ bekannte Oberflächendefekt ausgemacht werden. Es gibt allerdings gehäuft Hinweise über eine Thrombusausbildung auf einer intakten Plaqueoberfläche. Es wird vermutet, dass hier apoptotische Endothelzellen eine entscheidende Rolle bei Veränderungen der Gefässwand spielen, die letzlich für die Thrombusbildung verantwortlich ist. Aus diesen Überlegungen heraus untersuchten wir in der vorliegenden Studie das Ausmaß von Endothelzellapoptosen innerhalb eines Karotisplaque bei symptomatischen und asymptomatischen Patientengruppen. Insgesamt wurden 38 stationäre Patienten mit einer ≥70%-igen ACI-Stenose in die Studie eingeschlossen. Als symptomatisch galten die Patienten, die im Sinne von retinalen oder zerebralen TIA’s oder durch sog. „minor strokes“ in einem Zeitraum von 60 Tagen vor dem Operationstag auffällig geworden waren. Das asymptomatische Patientengut bestand aus den Patienten, bei denen die Karotisstenose als „Zufallsbefund“ aus Routineuntersuchungen in Klinik oder bei niedergelassenen Kollegen entdeckt wurde. Die Plaques wurden “en bloc” exzidiert. In den überwiesenden 33 Fällen wurde die Eversionstechnik durch den Operateur angewendet, bei der das Restlumen unbeschädigt bleibt. Nach Entfernung wurden die Präparate umgehend in 4%-iges Formalin fixiert. Nach Dekalzifizierung erfolgte die transversale Sektionierung in 2mm Scheiben. Jeder 2mm Block wurde in Paraffin eingebettet. Insgesamt wurde dann die Gesamtheit aller 279 Blöcke weiter in 3μm dicke Sektionen geschnitten. Das Vorliegen einer rupturierten Gefässwand wurde als ein intimaler Defekt grösser als 1000μm Breite definiert und für jedes Präparat dokumentiert. Die vitalen Zellen der Endothelschicht wurden durch ein standardisiertes Färbeprotokoll (CD31 Immunhistochemie) sichtbar gemacht. Apoptotische Endothelzellen konnten nach Anwendung der TUNEL-Technik visualisiert werden. Die Färbemethoden wurden jeweils zur Orientierung an angrenzenden Sektionen des Plaques durchgeführt. Die Bilder wurden digitalisiert und bei 40-facher Vergrösserung ausgezählt. Eine Endothelzelle wurde als apoptotisch gewertet, wenn sie jeweils eine positive CD31-Markierung sowie eine positive TUNEL-Färbung in angrenzenden Gewebsschnitten auf sich vereinte. Um das Ausmass der Apoptosen in den Reihen des Endothels zu quantifizieren wurde zunächst die Prozentzahl apoptotischer Endothelzellen pro Plaque Sektion ermittelt und anschliessend durch Berechnung des Medians aller konsekutiven Sektionen die mittlere Prozentzahl apoptotischer Zellen erhoben. Insgesamt war das Auftreten von Apoptose innerhalb des Endothel rar; trotzdem zeigte die symptomatischen Patientengruppe eine signifikant höhere mittlere Prozentsatz apoptotischer Endothelzellen im Vergleich zu dem asymptomatischen Kollektiv. Zwischen den rupturierten und unrupturierten Plaques konnte kein signifikantes Ergebnis erzielt werden, beide Gruppen unterschieden sich kaum. Trotz des möglichen Stellenwerts apoptotischer Endothelzellen bei der fortgeschrittenen Atherosklerose existieren bis heute keine Studien, die das Ausmass derselben in Beziehung zu klinischen Symptomen gebracht haben. Bislang konnte der Nachweis dieser Zellreihe in atherosklerotischen Karotisplaques besonders im poststenotischen Bereich erbracht werden. Veränderungen lokaler Hämodynamik scheinen hier eine Rolle bei der Induktion von Apoptose zu spielen. Da in der hier vorliegenden Arbeit sich der Grad der Stenose kaum unterscheidet müssen alternative Wege bestehen, die Apoptose in atheromatösen Plaques fördert. Apoptotische Endothelien fördern ihrerseits prokoagulatorische Eigenschaften durch vermehrte Expression von thrombogenen Faktoren der Gerinnungskaskade. Das klassische Dogma der Plaqueruptur mit konsekutiver Freilegung des nekrotischen Kerns und Thrombusbildung muss daher erweitert werden, da nicht alle Plaques der vorliegenden Studie diese Oberflächendefekte aufwiesen. Durch das leichte Übergewicht des symptomatischen Kollektivs lassen sich diese Theorien der Apoptose als kritischer Faktor in der Progression atherosklerotischer Herde weiter untermauern, benötigen aber weitere Studien um unter Umständen völlig andere Mechanismen aufzudecken.
• Atherosclerosis is one of the leading causes of death in the western civilization. The carotid bifurcation is one of the main localizations of an atherosclerotic plaque formation leading to neurological symptoms when a certain amount of lumen is becoming narrowly obstructed. In high-grade ICA atherosclerotic lesions, the most common pathological feature associated with the development of symptoms is a surface disruption of the plaque, mostly described in the literature as “rupture”. However there is substantial evidence that thrombosis can also occur on a plaque surface which does not feature a site of rupture showing an entirely intact luminal vascular wall. It has been suggested in the past that an increased rate of endothelial cell (EC) apoptosis can lead to an altered state of the vascular wall prompting the formation of a local thrombus. Therefore we investigated the extent of EC apoptosis in patients with unstable, recently symptomatic, and patients with stable, asymptomatic high-grade ICA stenosis. A total of 38 inpatients with a degree of stenosis ≥70% were included prospectively in the study. Patients were classified as “symptomatic” if they reported retinal or cerebral transcient ischaemic attacks or minor ischaemic strokes attributable to the high-grade ICA stenosis less than 60 days prior to surgery. The group of “asymptomatic” patients included the patients that were prepared for surgery after a stenosis was detected during a routine-examination by an external physician (other hospital, home-physician). All carotid plaques were excised en bloc. In 33 cases, the eversion technique was used so that the residual lumen was not incised. After removal in the OR, the specimen was immediately fixed in 4% formalin, decalcified, and sectioned transversely at 2mm intervals. Each 2mm tissue block was embedded separately in paraffin. A total number of 279 blocks were further sliced into 3μm sections. Rupture was defined as an intimal defect larger than 1000μm in width, exposing the necrotic core of the atheroma. The vital cells of the endothelial layer were visualized by staining with CD31 using the standardized immunohistochemistry protocol. Detection of in situ apoptotic endothelial cells was made possible using the TUNEL method according to the protocol described above. We selected adjacent sections for immunohistochemistry and TUNEL staining. Images of all plaque sections were digitized at a magnification of 40x. ECs were considered apoptotic if they showed both positive immunohistochemistry staining and positive TUNEL staining in the adjacent section. To measure the degree of EC apoptosis, the percentage of apoptotic ECs per plaque section was counted. Afterwards we worked out the mean percentage of apoptotic ECs by calculating the mean from all consecutive sections. Overall, EC apoptosis was a rare finding; nevertheless the symptomatic patients showed a significantly higher median mean percentage of apoptotic endothelial cells. However, there was just a slight difference between the median average percentage of apoptotic ECs in ruptured and unruptured plaques. In the sub-group of unruptured plaques, the median average percentage of apoptotic cells was 0.0 and 0.3 in asymptomatic and symptomatic patients respectively. Despite the potential implications of EC apoptosis in advanced atherosclerosis, no study investigating the relationship between the degree of EC apoptosis and clinically relevant thromboembolic events has yet been published. However, increased rates of EC apoptosis have been observed in atherosclerotic ICA plaque, particularly downstream from the point of maximal stenosis. Local hemodynamic contribute largely to EC turnover and apoptotic death; the fact that the patients in this study did not show large differences in the degree of stenosis suggests that other mechanisms promote EC apoptosis in plaques. It is thought that apoptotic endothelial cells become procoagulant through a variety of mechanisms each leading to the expression of procoagulatory states (e.g. expression of TF). Interestingly, the classical dogma of a ruptured-plaque can not be found on all thrombosed plaques. In these cases it is possible that EC apoptosis plays the major role in the promotion of surface thrombosis. Our results support this theory, showing that endothelial cell apoptosis is a major factor in the atherosclerotic lesion and that a slight advantage of EC apoptosis in the symptomatic collective can be spotted.