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Das Risiko bakterieller Infektionen durch Thrombozytenkonzentrate (TKs) ist derzeit immer noch das höchste in der Transfusionsmedizin. Dies wird hauptsächlich durch die empfindliche Physiologie der Thrombozyten und die damit verbundene erforderliche Lagerung dieser Produkte bei Raumtemperatur von 22°C ± 2°C bedingt, welche eine optimale Wachstumsbedingung für Bakterien darstellt. Mit Hilfe von predonation sampling und gewissenhaft durchgeführter Hautdesinfektion beim Spender wurden die Grundlagen zur Optimierung der bakteriellen Sicherheit von Thrombozytentransfusionen geschaffen. Allerdings ist die Übertragung von Bakterien bei der Punktion des Spenderarms immer noch die Hauptursache für bakterielle Kontamination von Thrombozytenspenden. In selteneren Fällen ist eine latente Bakteriämie des Spenders ursächlich. Denkbar ist auch eine Verunreinigung bei der Produktion.
Die Studie, welche in drei Phasen verlief, sollte die bakterielle Sicherheit von Thrombozytenkonzentraten und somit auch die Patientensicherheit dieser Produkte verbessern und gleichzeitig die Ressource „Thrombozytenkonzentrat“ optimieren.
In Phase 1 wurden drei zufällig gehäufte Transfusionszwischenfälle des Jahres 2016 untersucht und Wachstumskinetiken der verursachenden Keime erstellt. Es konnte bestätigt werden, dass Hautkeime weiterhin eine relevante Ursache bakterieller Verunreinigung darstellen. Eine Erweiterung des Spenderfragebogens bezüglich der Abfrage eines Risikos für die Übertragung multiresistenter Erreger und Kontakt zu besonderen tierischen Risikogruppen sowie die Einführung einer Mundraumkontrolle bei der ärztlichen Untersuchung könnten das Risiko der bakteriellen Kontamination der Blutspende eventuell reduzieren.
Phase 2 verglich mit PCR, Bactiflow und BacT/ALERT drei bakterielle Schnelltestmethoden synoptisch miteinander. Das Hauptaugenmerk lag hierbei auf der diagnostischen Sensitivität nach Poolbildung von bis zu 10 TKs (Pool-TKs sowie Apheresen).
Alle drei getesteten Bakterienscreeningmethoden zeigten einen zuverlässigen Bakteriennachweis auch nach erfolgter Poolbildung. Bactiflow-Mini-Pooltests konnten 2016 in die Routinetests des DRK Blutspendedienstes Baden-Württemberg-Hessen eingeführt werden und haben in der Zeit von 2016 bis 2019 zum Nachweis von zwölf Bakterienstämmen in Thrombozytenkonzentraten geführt und somit Transfusionszwischenfälle verhindert. Die Daten dieser Promotionsarbeit ermöglichen auch die Anwendung einer generischen 16s-DNA PCR-Methode oder des BacT/ALERT-Verfahrens als alternative Schnelltestmethoden.
In Phase 3 wurde schließlich die Transportstabilität der Proben validiert. Dadurch sollte Bactiflow als sicheres Schnelltestverfahren für TK-Pooltests an drei Standorten für den DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen und den DRK Blutspendedienst Nord-Ost implementiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl nach einem Transport bei Raumtemperatur als auch bei 4°C die Bakterienkonzentration innerhalb von 24 h auch bei 5er- und 10er-Pool-TKs für alle drei Testverfahren nicht unter die Nachweisgrenze fällt. Die Bakterientestung von TKs ist somit auch nach Zentralisierung an den Instituten Frankfurt und Ulm des DRK Blutspendedienstes Baden-Württemberg-Hessen sowie dem Institut Plauen des DRK Blutspendedienstes Nord-Ost zuverlässig möglich.
Die hiesige Studie konnte dabei helfen, mögliche Ursachen für bakterielle Kontaminationen zu detektieren. Ebenso wurden mit Bactiflow, 16s realtime-PCR und BacT/ALERT drei Bakterienscreeningverfahren erfolgreich für Pools von bis zu zehn Pool- oder Apherese-TKs getestet. Zuletzt konnte auch für alle dieser drei Methoden eine sichere Nutzung nach 24-stündigem Transport sowohl bei Raumtemperatur als auch unter Kühlung bei 4 °C gezeigt werden. Insgesamt konnte die Studie somit zu einer Ressourcenoptimierung und einer Verbesserung der Patientensicherheit beitragen.
Nachdem die Sicherheit der Blutprodukte in den letzten Jahrzehnten vor allem bei transfusionsmedizinisch relevanten Viren wie HIV-1, HCV und HBV wesentlich durch die Einführung von molekularen Nachweismethoden auf Restrisiken unter 1 zu 1 Million reduziert werden konnte, liegt der aktuelle Fokus der Transfusionsmedizin auf der Vermeidung von bakteriellen Übertragungen. Dabei stehen vor allem die Thrombozytenkonzentrate im Vordergrund, da diese bei Raumtemperatur gelagert werden und somit für viele Bakterien ideale Wachstumsbedingungen darstellen. Die vorliegende Arbeit hat dabei in vier aufeinander aufbauenden Phasen systematisch die klinische Effizienz eines photochemischen Pathogeninaktivierungsverfahrens untersucht.
Phase 1: Darstellung des Wachstumsverhaltens von 8 transfusionsmedizinisch relevanten Keimen mittels der Spiking-Versuche in Thrombozytenkonzentraten. Für die nachfolgenden Phasen sind nur die Bakterienstämme ausgewählt worden, die nachweislich zu einer Vermehrung in Thrombozytenkonzentraten geeignet sind.
Phase 2: In den Experimenten mit Vollblutkonzentraten zeigt sich bei der Spikingkonzentration von 100 CFU/Beutel für alle ausgewählten Keime eine 100%ige Inaktivierungseffizienz. Bei der Anfangskonzentration von 1000 CFU/Beutel ergibt sich für den Keim Klebsiella pneumoniae (PEI-B-08-09) eine Inaktivierungseffizienz von 75% und für den Keim Bacillus cereus eine Inaktivierungseffizienz von 50%. Alle anderen Keime haben in den Experimenten mit der höheren Spikingkonzentration eine Inaktivierungseffizienz von 100%.
Phase 3: Für den Keim Klebsiella pneumoniae (PEI-B-08-09) zeigt sich in den Experimenten mit Pool-TKs schon bei der niedrigen Anfangskonzentration eine Inaktivierungseffizienz von 75%. Bei der Spikingkonzentration von 1000 CFU/Beutel ergibt sich erneut für die Keime Klebsiella pneumoniae und Bacillus cereus eine Inaktivierungseffizienz von 50%. Alle anderen Keime weisen sowohl bei der niedrigen als auch bei der hohen Bakterienkonzentration eine 100%ige Pathogeninaktivierungseffizienz auf.
Phase 4: In den Experimenten mit Apherese-TKs zeigt sich für alle untersuchten Keime sowohl bei der niedrigen als auch bei der hohen Spikingkonzentration eine 100%ige Inaktivierungseffizienz.
Aus diesen Experimenten geht hervor, dass man mittels photochemischen Pathogeninaktivierungsverfahrens keine 100%ige Inaktivierungseffizienz erreichen kann. Vielmehr ist die Inaktivierungseffizienz zum einen von der bakteriellen Ausgangskonzentration, zum anderen aber auch vom Zeitpunkt der Anwendung des Verfahrens abhängig. Somit sollte der Begriff „ Pathogeninaktivierungsverfahren“ besser durch den Begriff des Pathogenreduktionsverfahrens ersetzt werden. Ferner wird anhand der Ergebnisse deutlich, dass die Anwendung von Pathogenreduktionsverfahren möglichst schnell nach der Spende erfolgen sollte. In diesem Zusammenhang haben Apherese-Thrombozytenkonzentrate gegenüber Pool-Thrombozytenkonzentraten einen Sicherheitsvorteil.
In dieser Arbeit wurden zur Funktionsanalyse gelagerter ThZ zwei ex vivo Messverfahren verwendet, die unterschiedliche Qualitäten der ThZ-Funktion quantifizieren. Die in vitro Aggregationsfunktion der ThZ wurde mittels Multiplate® Analyzer untersucht, die Mitochondrienfunktion mittels Oxyraph-2k.
Der Multiplate® Analyzer ist eine wohl etablierte und gut zugängliche POC-Methode, die zeitnah verlässliche Daten zur ThZ-Aggregationsfähigkeit in Vollblutproben liefert. Von Interesse war zunächst die Frage nach der Durchführbarkeit valider Multiplate®-Messungen an POOL-TK. Das für Vollblutproben konzipierte Multiplate® kann unseren Ergebnissen zufolge zur in vitro Testung von POOL-TK herangezogen werden. Die Kombination der verwendeten Mischungsverhältnisse, Suspensionsmedien und Reagenzien eignen sich zur ThZ-Stimulation außerhalb der physiologischen Umgebung des Vollbluts. In zukünftigen Studien mit höheren Fallzahlen sollte jedoch die Messgenauigkeit des Multiplate® an TK durch Anpassungen der Suspensionsmedien, sowie der ThZ- und Reagenzienkonzentration überprüft und optimiert werden. Die Entwicklung der ThZ-Funktion im Verlauf der viertägigen TK-Haltbarkeit wurde hinsichtlich der thrombozytären Aggregations- und Mitochondrienfunktion beurteilt. Weiterhin wurde der Einfluss einer kontinuierlichen Agitation durch Vergleich mit der TK-Lagerung ohne Agitation untersucht. Während die Aggregationsfähigkeit der ThZ über den viertägigen Beobachtungszeitraum überwiegend erhalten blieb, verzeichnet die mitochondriale Funktion einen signifikanten Rückgang. Unter kontinuierlicher Agitation der TK verzeichnete sich keine signifikante Abnahme der thrombozytären Aggregationsfähigkeit im Laufe der TK-Haltbarkeit. Wurden die TK ohne Agitation gelagert zeigte das Aggregationsausmaß in den ersten Tagen gegenüber den richtlinienkonform gelagerten TK keine signifikante Verschlechterung. Am vierten Tag resultierte lediglich die ThZ-Stimulation mit TRAP in einer signifikant verminderten Plättchenaggregation in der Gruppe der nicht agitierten TK. Eine Toleranz der TK bezüglich temporären Agitationspausen von ein bis zwei Tagen ist demnach anzunehmen. Nach längeren Agitationspausen ist mit signifikanten Beeinträchtigungen der Aggregationsfunktion zu rechnen.
Der Oxygraph-2k ist ein anerkanntes Messgerät zur Analyse der mitochondrialen Leistungsfähigkeit mittels hochauflösender Respirometrie. Die Daten dieser Arbeit demonstrieren eine signifikante Abnahme der mitochondrialen Leistungsfähigkeit mit - 116 -zunehmendem Alter der TK. Es zeigten sich keine Unterschiede zwischen kontinuierlich agitierten und ruhenden TK am Ende der Lagerungsperiode. Auch an den restlichen Lagerungstagen waren ruhende TK nicht verstärkt in ihrer mitochondrialen Leistung eingeschränkt, als stetig agitierte TK. Dies impliziert, dass sich die mitochondriale Leistungsfähigkeit im Laufe der TK-Alterung reduziert, ungeachtet dessen, ob die Lagerung unter der empfohlenen kontinuierlichen oder unterlassenen Agitation erfolgt. Aus den Multiplate®- und Oxygraph-Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass ein TK den für die Transfusion erforderlichen Qualitätsanspruch nicht durch kurzzeitige Agitationspausen verliert. Im Klinikalltag kann es, irrtümlich sowie durch Organisationsversagen bedingt, zu unterbrochener oder gar unterlassener Agitation vor TK-Transfusion kommen. Gemäß den Ergebnissen dieser Arbeit zufolge, wird darunter jedoch die TKQualität nicht nennenswert negativ beeinflusst.
Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Untersuchung des Einflusses von Extrembedingungen, wie Kälte von 4°C oder Be- und Entschleunigungen sowie Turbulenzen beim Transport durch Rohrpostsysteme. Die Mehrzahl der Testergebnisse verzeichnete keine signifikante Beeinträchtigung der ThZ-Aggregationsfunktion. Die vorübergehende, fehlerhafte Deposition eines TK im Kühlschrank und der Rohrpostversand können somit als unbedenklich für die mittels Multiplate® und Oxygraph gemessenen TK-Qualitätsparameter angesehen werden.
Die Gesamtheit der Ergebnisse zeigt, dass kurzfristige Abweichungen von der richtlinienkonformen TK-Lagerung keine negativen Auswirkungen auf die thrombozytäre Aggregationsfähigkeit und Mitochondrienfunktion ausüben. Die Berücksichtigung dieser Erkenntnisse könnte verhindern, dass kurzzeitig fehlgelagerte TK verworfen werden, was sich positiv auf die Nutzung dieser begrenzten Ressource auswirken würde. Als Einschränkung ist zu erwähnen, dass die dargebotenen Veränderungen lediglich ex vivo ermittelt wurden. Aufgrund der Nutzung etablierter Verfahren kann angenommen werden, dass sich unsere Ergebnisse gleichsinnig auf die tatsächliche in vivo ThZ-Funktion auswirken. Der Effekt auf die in vivo ThZ-Funktion muss in zukünftigen Studien verifiziert werden. Insbesondere bleibt die Frage offen, inwiefern ein Zusammenhang zwischen einer eingeschränkten mitochondrialen Respirationsleistung und der Aggregationsfunktion besteht.