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In dieser Arbeit wurden Methoden entwickelt, mit denen das Auflösungsverhalten schwer wasserlöslicher schwacher Säuren verbessert werden kann. Als Modellwirkstoffe wurden drei Vertreter der Sulfonylharnstoff-Gruppe (Glibenclamid, Glipizid und Glimepirid) gewählt. Diese Wirkstoffe, werden zur oralen Standardtherapie des Typ 2 Diabetes eingesetzt. Die Ergebnisse aus den Löslichkeits- und Freisetzungsuntersuchungen der reinen Arzneistoffe bildeten in dieser Arbeit den Ausgangspunkt der Entwicklungsarbeit. Um den Einfluss der galenischen Methoden auf das Freisetzungsverhalten der entwickelten Formulierungen besser zu beurteilen, wurden ebenfalls entsprechende Handelspräparate (Euglucon N 3,5 mg, Luditec 5 mg und Amaryl 4 mg) untersucht. Zunächst wurden mit Glibenclamid und dem natürlichen ?-CD sowie verschieden Cyclodextrin-Derivaten (M-?-CD und HP-?-CD) binäre Komplexe im molaren Verhältnis von 1:2 (Glibenclamid:CD) hergestellt und charakterisiert. Anschließend wurden feste Lösungen aus Glibenclamid und Kollicoat(r) IR bzw. PVP K30 entwickelt. Bei den nachfolgenden Freisetzungsuntersuchungen zeichnete sich im Falle der binären Cyclodextrin-Komplexe ab, dass der Glibenclamid-HP-?-CD-Komplex das beste Freisetzungsverhalten von Glibenclamid in den untersuchten Medien erreichte. Bei den festen Lösungen von Glibenclamid gab es zwischen den beiden untersuchten Polymeren keine signifikanten Unterschiede im Ausmaß der Glibenclamidfreisetzung. Im nächsten Schritt wurden ternäre Komplexe (Glibenclamid-HP-?-CD-Polymer) entwickelt, eine Kombination aus binären CD- Komplexen und festen Lösungen. Als dritte Komponente wurden Kollicoat(r) IR, PVP K30 und PEG 6000 in unterschiedlichen Zusätzen, 5, 10 und 20% bezogen auf den zugrunde liegenden binären Glibenclamid-HP-?-CD-Komplex eingearbeitet. Die Charakterisierung der verschiedenen ternären Komplexe ergab, dass das beste Freisetzungsverhalten bei den Komplexen, welche einen 10%igen Kollicoat(r) IR- bzw. 20%igen PVP K30-Zusatz enthielten, generiert werden konnte. Bei den drei verwendeten Methoden (binäre-, ternäre Komplexe und feste Lösungen) erhielt man während der Freisetzungsuntersuchungen in den Medien mit einem pH-Wert unterhalb des pKs-Wertes von Glibenclamid (5,4) eine übersättigte Wirkstofflösung, was zum Teil innerhalb kürzester Zeit zum Präzipitieren des Wirkstoffes führte. Initiale DSC-Untersuchungen hatten gezeigt, dass Glibenclamid in den beschriebenen Präformulierungen in amorpher Form vorlag, was der Grund für die rasche Freisetzung war. Anschließend wurde versucht, das Präzipitieren zu verlangsamen und im besten Fall zu verhindern. Hierfür wurde HPMC in verschiedenen Formen verwendet. Das einfache Hinzumischen von HPMC in eine Gelatine-Kapsel zu der Glibenclamid-Formulierung führte aufgrund von Agglomeratbildungen zu einer deutlichen Verzögerung der Wirkstofffreisetzung. Pankreatin als Zusatz zum Freisetzungsmedium konnte die Bildung eines Agglomerates nicht verhindern, was darauf schließen ließ, dass dieses nicht durch sogenanntes "Cross-linking" der Gelatine entstanden war. In einem nächsten Schritt wurden HPMC-Kapseln eingesetzt. Die Glibenclamidfreisetzung konnte durch einfaches Austauschen der Gelatine-Kapseln gegen Vcaps(r) Plus-Kapseln in allen untersuchten Medien deutlich gesteigert werden, was auf die durch die Anwesenheit von HPMC verzögerte Präzipitation des Wirkstoffes im Freisetzungsmedium zurückzuführen war. Im nächsten Schritt wurde, die Formulierungsmethode von Glibenclamid, auf Glipizid übertragen. Es wurde analog zu Glibenclamid ein binärer Glipizid-HP-?-CD-Komplex im molaren Verhältnis von 1:2 (Glipizid:HP-?-CD) hergestellt. Dieser Komplex führte zu einer deutlichen Verbesserung des Auflösungsverhaltens von Glipizid, was zu einer annähernd 100%igen Wirkstofffreisetzung in allen untersuchten Medien führte. Weiterhin wurden die mit Glibenclamid entwickelten Methoden auch auf Glimepirid übertragen. Die Formulierung von Glimepirid zu einem binären Glimepirid-HP-?-CD-Komplex führte zu einer höheren Wirkstofffreisetzung, verglichen mit der kristallinen Reinsubstanz und des Handelspräparates. Durch die Verarbeitung von Glimepirid in ternären Komplexen erhöhte sich das Ausmaß der Wirkstofffreisetzung deutlich. Mit Kollicoat(r) IR konnte eine Wirkstofffreisetzung von ca. 60% der Dosis und mit PVP K30 als dritter Komponente sogar ca. 85% Wirkstofffreisetzung in Blank FeSSIF erzielt werden. Das Präzipitieren des Wirkstoffes nach initialer Wirkstofffreisetzung in Blank FeSSIF konnte durch den Einsatz von Vcaps(r) Plus-Kapseln deutlich reduziert werden. Stabilitätsuntersuchungen, welche mit den in dieser Arbeit verwendeten Präformulierungen durchgeführt wurden zeigten, dass der jeweilige Wirkstoff auch nach einem Jahr der Lagerung bei Raumtemperatur und < 30% rel. Luftfeuchte, in amorpher Form in den entsprechenden Präformulierungen vorlag. All diese Untersuchungen zeigten eindrucksvoll, dass sich Cyclodextrin-Derivate in Kombination mit hydrophilen Polymeren, dazu eigneten, die Verfügbarkeit schwer löslicher Wirkstoffe im Dünndarm für deren Resorption zu verbessern. Es wurde gezeigt, dass die Herstellungsmethodik der Cyclodextrin-Komplexe einen wesentlichen Einfluss auf die Wirkstofffreisetzung hatte.
Die Translokation von gelösten Stoffen über zelluläre Membranen ist ein essentieller biologischer Prozess, der durch eine Vielfalt an integralen Membranproteinen vermittelt wird. Diese sind in den selektiven Austausch verschiedenster Stoffe bzw. Teilchen involviert und ermöglichen somit die Kommunikation zwischen den einzelnen Zellkompartimenten untereinander bzw. mit der extrazellulären Umgebung. Eine der größten Familien paraloger Proteine, die den vektoriellen Transport von Substanzen über Zellmembranen katalysieren, stellen die ATP‐binding cassette (ABC)‐Transporter dar. Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen bisher untersuchten Organismen von Prokaryoten bis hin zu höheren Eukaryoten vertreten und übernehmen essentielle Funktionen in einer Vielzahl von zellulären Abläufen. ABC‐Transporter zeichnen sich durch eine breite Substratdiversität aus, d.h. sie energetisieren unter ATP‐Verbrauch die Translokation zahlreicher, strukturell und chemisch unterschiedlicher Substanzen wie Zucker, Lipide, Ionen, Aminosäuren, Proteine oder auch zelltoxische Stoffe. In Bakterien können sie sowohl als Importproteine fungieren, welche hauptsächlich die Aufnahme von Nährstoffen vermitteln, als auch als Exportproteine, deren Hauptaufgabe es ist, zelltoxische Substanzen aus der Zelle heraus zu schleusen. Eukaryotische ABC‐Transporter sind sowohl in der Plasmamembran als auch in den intrazellulären Membranen zu finden – beispielsweise in denen des Endoplasmatischen Retikulums, des Golgi Apparats, der Lysosomen, der Peroxisomen und der Mitochondrien. Sie fungieren als Exportproteine und sind z.B. an der Ionen‐Homöostase, der Antigenprozessierung, der Insulinfreisetzung oder am Cholesterol‐ und Lipidtransport beteiligt. ...
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiger Botenstoff, der über die Regulation des Vasotonus, die Hemmung der Thrombocytenaggregation sowie die Stimulation der Angiogenese auf die vaskuläre Homöostase einwirkt. Das wichtigste NO-produzierende Enzym im kardiovaskulären System ist die endotheliale NO-Synthase (eNOS), deren Aktivität durch posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung und Acylierung, durch Interaktionen mit regulatorischen Proteinen wie Ca2 /Calmodulin und Caveolin sowie durch differentielle subzelluläre Lokalisation reguliert wird. Dabei sind die Faktoren, welche die (Trans-)Lokation der eNOS zwischen subzellulären Kompartimenten wie den Caveolae der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat dirigieren, weitgehend unbekannt. Zur Identifizierung neuer Interaktionspartner wurde humane eNOS im "yeast two-hybrid"-System als "Köderprotein" eingesetzt und dabei das Fragment eines neuen humanen Proteins identifiziert, das vorläufig NOSTRIN (für: eNOS traffic inducer) genannt wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang nun die Klonierung der kompletten NOSTRIN-cDNA, der Nachweis einer spezifischen Interaktion von eNOS und NOSTRIN in Säugerzellen sowie die Charakterisierung von NOSTRIN als Modulator der subzellulären Lokalisation und Aktivität von eNOS. Nach der kompletten Klonierung der NOSTRIN-cDNA mit Hilfe einer 5'-RACE resultierte ein offenes Leseraster von 506 Aminosäuren entsprechend einer Größe von ca. 58 kDa für NOSTRIN. Eine Datenbankrecherche zum Vergleich der NOSTRIN-Sequenz mit Sequenzen bekannter Proteinmotive ergab die Vorhersage einer N-terminalen Cdc15-Domäne sowie einer C-terminalen SH3-Domäne. Die direkte Interaktion zwischen eNOS und NOSTRIN konnte durch Copräzipitation in vivo und in vitro bestätigt werden. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die SH3-Domäne von NOSTRIN essentiell für die Bindung an eNOS ist. Zur Untersuchung des Einflusses von NOSTRIN auf die eNOS-Lokalisation wurden stabil transfizierte CHO-Zellen, die eNOS überexprimierten ("CHO-eNOS") eingesetzt. In der Immunofluoreszenz war eNOS vornehmlich in Assoziation mit der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat zu sehen. Mit Hilfe des Semliki-Forest-Virussystems (SFV) wurde nun NOSTRIN transient überexprimiert; dabei zeigte sich für NOSTRIN eine vesikelartige Verteilung im Cytoplasma. Die NOSTRIN-Überexpression führte zu einer drastischen Umverteilung von eNOS, die nun in charakteristischen vesikelartigen Strukturen mit NOSTRIN colokalisierte. Die Verwendung von NOSTRIN-Konstukten, bei denen die SH3- Domäne deletiert war ("NOSTRIN.SH3"), veränderte zwar die typische NOSTRIN-Lokalisation nicht, ließ aber auch die subzelluläre Verteilung von eNOS unverändert, so dass NOSTRIN.SH3 und eNOS in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten lokalisiert waren. Mit Hilfe der Immunofluoreszenz konnte ebenfalls eine Colokalisation von NOSTRIN und Caveolin-1, einem inhibitorisch wirkenden Interaktionspartner von eNOS, nachgewiesen werden. Die Analyse von Copräzipitationen mit NOSTRIN bzw. NOSTRIN.SH3 zeigte, dass Caveolin-1 in eNOS-unabhängiger Weise an NOSTRIN bindet, so dass ein ternärer Komplex aus NOSTRIN, eNOS und Caveolin-1 resultiert. Zur Klärung der Frage, ob NOSTRIN neben der subzellulären Lokalisation auch die Aktivität von eNOS beeinflusst, wurde die NO-Freisetzung von CHO-eNOS-Zellen analysiert. Dabei ergab sich, dass die transiente Überexpression von NOSTRIN in CHO-eNOS-Zellen die eNOS-Aktivität um 62 % im Vergleich zu Kontrollzellen reduzierte. In humanen primären Endothelzellen konnte mittels Immunoblotting und Immunofluoreszenzmikroskopie das Vorkommen von endogenem NOSTRIN sowie dessen Colokalisation mit endogener eNOS an der Plasmamembran nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation führen zur Hypothese, dass NOSTRIN als "molekulare Klammer" zwischen eNOS und Caveolin-1 dient, eine dynamische Umverteilung von eNOS innerhalb der Zelle vermittelt und damit das Enzym - direkt und/oder indirekt - inhibiert. Somit dürfte NOSTRIN als Modulator der Aktivität und Lokalisation von eNOS eine wichtige Rolle bei der Regulation der endothelialen NO-Produktion spielen.
The technique of site-specific fluorescence labelling with Tetramethylrhodaminemaleimide (TMRM) in combination with two electrode voltage-clamp technique (TEVC), an approach that has been named voltage clamp fluorometry (VCF), has been used in this work to study the Na,K-ATPase. The TMRM dye has the ability to attach covalently to cysteine residues and it responds to changes in the hydrophobicity of its local environment. We exploited this property using a construct of the Na-pump in which the native, extracellularly accessible cysteines were removed and cysteine residues were introduced by site-directed mutagenesis in specific positions of the Na-pump. In this way it was possible to detect site-specific conformational rearrangements of the Na-pump in a time-resolved fashion within a native membrane environment. In particular this technique allows to resolve reactions with low electrogenicity that cannot be satisfactorily analyzed with purely electrophysiological techniques and to identify the conformations of the enzyme under specific ionic composition of the measuring buffers. We used VCF to study the influence that several cations like Na+, K+, NMG+, TEA+ and BTEA+ exert on the distribution of the Na,K-ATPase between several enzymatic intermediates and on some of the reactions related to cation transport. To this end we utilized the mutants N790C in the loop M5-M6 and the mutant E307C, T309C, L311C and E312C in the loop M3-M4. From the correspondence of the fluorescence changes with the activation and inhibition of pumping current, by K+ and ouabain respectively, and from the fact that in Na+/Na+ exchange conditions the voltage distribution of charge movement and fluorescence changes evoked by voltage jumps are in reasonable agreement we conclude that through the fluorescence signals measured from these mutants, we can indeed monitor conformational changes linked to transport activity of the enzyme. For the mutants N790 and L311, it was found that the Na+ dependence of the amplitude and kinetics of the fluorescence signal associated with the E1P-E2P transition is in agreement with the prediction of an access channel model describing the regulation of the access of extracellular Na+ to its binding site. In particular for the mutants E307 and T309 it was found that in Na+/Na+ exchange conditions, the conformational change tracked by the fluorescence was much slower than the charge relaxation at hyperpolarized potentials while the kinetics was very similar at depolarized potentials. This implies that at hyperpolarized potentials the conformational change connected to the E1P-E2P transition does not give a large contribution to the electrogenicity of the process which is also consistent with the access channel model. On the mutant N790C it was found that the external pH does not seem to have any effect on the E1P-E2P equilibrium even if it seems to modulate the fluorescence quantum yield of the dye. Fluorescence quenching experiments with iodide and D2O indicate that at hyperpolarized potentials the local environment of the mutant N790C, experiences a small change in the accessibility to water without major changes in the local electrostatic field ...
Metallorganische Netzwerke (engl. metal-organic frameworks, MOFs) sind eine neuartige Klasse mikro/mesoporöser Materialien, für die eine Vielzahl von möglichen Anwendungen demonstriert werden konnte. Das Ziel dieser Arbeit besteht in der Synthese von MOF Mikro/Nanopartikeln sowie der Herstellung von sogenannten Oberflächen-deponierten MOFs (engl. surface-attached metal-organic frameworks, SURMOFs). MOF Partikel mit kontrollierbarer Morphologie und Größe wurden unter milden Bedingungen synthetisiert. Um MOFs als Sensoren, intelligente Membrane, oder in nanotechnologischen Bauelementen verwenden zu können, ist die Integration auf der jeweiligen Oberfläche wichtig. Daher beschäftigt sich der Großteil dieser Arbeit mit der kontrollierten Abscheidung von SURMOFs auf verschiedenartigen Trägermaterialien. Etliche interessante Eigenschaften (z.B. die Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Gegenwart von Gastmolekülen und die dynamische Gasadsorptionskapazität) der SURMOFs wurden untersucht.
The Na+/proline transporter of E. Coli (PutP) is responsible for the uptake of proline which is subsequently used not only as a carbon and nitrogen source and a constituent of proteins but also as a particularly effective osmoprotectant. However, for a long time there was little known about the single steps in the reaction cycle of this transporter and only few details about its structure-function relationship are available. Aim of the present work was to achieve a deeper understanding about the kinetic properties of the Na+/proline transporter and to get insights into the structure-function relationship of the substrate binding. To answer these questions different techniques were used. By using the novel SSM technique combining the preparation of PutP proteoliposomes it was possible to demonstrate for the first time the electrogenic substrate binding to PutP transporter. Due to rapid solution exchange measurements on the SSM it was additionally possible to obtain time resolved information about the kinetic details of the cytoplasmic substrate binding sites which were not available by previous steady state and equilibrium binding measurements. Pre-steady-state charge translocation was observed after rapid addition of one or both of the cosubstrates Na+ and/or proline to the PutP-WT proteoliposomes adsorbed on the SSM. Thereby it was possible to link the observed electrical signals with the binding activity of PutP. The observed Na+ and/or proline induced charge displacement were assigned to an electrogenic Na+ and/or proline binding process at the cytoplasmic face of the enzyme with a rate constant of k > 50 s-1 proceeding the rate limiting step of the reaction cycle. Furthermore, based on the kinetic analysis of the electrical signals obtained from the measurements of PutP on SSM, the following characteristics of the substrates binding in PutP were deduced: (1) both Na+ and proline can bind individually to the transporter. Under physiological conditions, an ordered binding mechanism prevails; while at sufficiently high concentrations, each substrate can bind in the absence of the other; (2) substrate binding is electrogenic not only for Na+, but also for the uncharged cosubstrate proline. The charge displacement associated with Na+ binding and proline binding is of comparable size and independent of the presence of the respective cosubstrate. In addition, it was concluded that Na+ accesses its binding site through a high-field access channel resulting in a charge translocation, whereas the binding of the electroneutral proline induces a conformation alteration involving the displacement of charged amino acid residue(s) of the protein; (3) Na+ and proline binding sites interact cooperatively with each other by increasing the affinity and/or the speed of binding of the respective cosubstrate; (4) proline binding proceeds in a two step process: low affinity (~ 0.9 mM) electroneutral substrate binding followed by a nearly irreversible electrogenic conformational transition; (5) membrane impermeable PCMBS inhibits both Na+ and proline binding to the inside-out orientated PutP transporter, indicating that rather than selectively blocking a specific binding site, PCMBS probably locks the enzyme in an inactive state. The possible targets for this SH-reagent are cysteines 281 and 344 located close to the cytoplasmic surface of the protein. Beyond it, transient electrical currents of PutP were also observed on the BLM after rapid addition of proline in the presence of Na+. This was possible by combining the conventional BLM technique with high-speed flash-photolysis of caged-proline. Indeed the signals on the BLM indicate the detection of a different underlying reaction process in comparison to the data achieved by the SSM technique. This has paved the way for supplemental information about the reaction cycle since it was possible to assign the flash-photolysis BLM signals to the proline binding step followed by the internalization of Na+ and proline into the liposome. Thereby it was found, that the presence of Na+ is indispensable and the time constant for the process is ~ 63 ms. Moreover, structure-function information about the Na+ and proline binding sites of PutP was obtained by investigating the functionally important amino acid residues Asp55, Gly63 and Asp187 with site-directed mutagenesis and the combined SSM technique. One finding is that the mutated proteins PutP-D55C and PutP-G63C showed no activity on the SSM. Therefore, it can be assumed that either both Asp55 and Gly63 are crucial for the structure of PutP protein, or they are located at or close to the Na+ and proline binding sites. Furthermore, the results obtained from PutP-D187N and PutP-D187C mutants on SSM suggest that Asp187 of PutP is likely to be involved in the Na+ binding at the cytoplasmic side of the backward running carrier. Taken together the results of the present work have substantially broadened the known picture of the Na+/proline transporter PutP thereby several steps of the reaction cycle were elucidated, and moreover, valuable insights into the structure-function relationship of the transporter have become available.
Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Synthese und strukturellen Charakterisierung von sandwichartig aufgebauten kupferhaltigen Organosiloxanen. Diese sollten nach Möglichkeit kristalline Eigenschaften aufweisen und ein interessantes magnetisches Verhalten zeigen. Es galt, die Beziehungen zwischen molekularer Struktur und magnetischen Eigenschaften herauszuarbeiten, um auf der Basis experimenteller Daten dem maßgeschneiderten Design neuer molekularer Magnete näher zu kommen. .... Die in der hier vorgelegten Arbeit erzielten Ergebnisse belegen, dass der Weg zur gezielten Erzeugung molekularer Magnete erfolgreich beschritten wurde. Es wird weiteren Arbeiten vorbehalten bleiben, Cluster der nun vorliegenden Art chemisch so zu verknüpfen, dass daraus polymere Ketten oder Netzwerke entstehen. Deren magnetisches Verhalten lässt erwarten, dass damit möglicherweise neue Materialien zugänglich werden, die dem Anspruch eines molekularen Magneten voll gerecht werden.
Unlimited self-renewal is an absolute prerequisite for any malignancy, and is the ultimate arbiter of the continuous growth and metastasis of tumors. It has been suggested that the self-renewal properties of a tumor are exclusively contained within a small population, i.e., the so-called cancer stem cells. Enhanced self-renewal potential plays a pivotal role in the development of leukemia. My data have shown that APL associated translocation products PML/RARalpha and PLZF/RARalpha increased the replating efficiency of mouse lin-/Sca1+ hematopoietic stem cells (HSCs). This effect is partly mediated by induction of gamma–catenin which is an important mediator of the Wnt signaling pathway and has been shown to be up regulated by the AML associated translocation products(AATPs). Suppression of gamma–catenin by siRNA can abrogate the increased replating efficiency induced by AATPs. Transduction of gamma–catenin in lin-/Sca1+ HSCs led to increased replating efficiency and the expression of stem cell markers Sca1 and c-kit. Additionally it induced accelerated cell cycle progression of mouse bone marrow HSCs. Transduction/transplantation mouse models have shown that ectopic expression of gamma–catenin in HSCs led to acute myeloid leukemia without maturation. These data suggest important roles of Wnt signaling pathway in the leukemogenesis induced by PML/RARalpha, PLZF/RARalpha and AML1/ETO. In contrast to AATPs, CML and Ph+-ALL associated translocation products p185(BCR-ABL) and p210(BCR-ABL) did not affect the self-renewal potential of hematopoietic stem/progenitor cells. However my studies indicated that their reciprocal translocation products p40(ABL/BCR) and p96(ABL/BCR) actually increased the replating efficiency of hematopoietic stem/progenitor cells. The effect is stronger when induced by p96(ABL/BCR) than by p40(ABL/BCR). It is very intriguing that p96(ABL/BCR) can activate Wnt signaling and up regulate the expression of HoxB4. Transduction/transplantation mouse model has shown that p40(ABL/BCR) and p96(ABL/BCR) both have their own leukemogenic potential. Given the fact that leukemic stem cells maintain the growth of tumor and are the origin of relapse, the cure of leukemia is dependent on the eradication of the leukemic stem cell and abrogation of aberrantly regulated self-renewal capability. Both t-RA and As2O3 have been shown to induce complete remission in APL patients with PML/RARalpha translocation product. However, t-RA as a single agent achieves completeremission (CR) but not complete molecular remissions (CMR). Therefore, virtually all patients will experience a relapse within a few months. In contrast to t-RA, As2O3 as a single agent is able to induce CR as well as CMR followed by long-term relapse-free survival in about 50% of APL patients even if relapsed after treatment with t-RA-containing chemotherapy regimens. Nothing is known about the mechanisms leading to the complete different clinical outcomes by the two compounds although both have been shown to induce differentiation of blast cells, proliferation arrest, induction of apoptosis and degradation of PML/RARalpha. We investigated the effect of t-RA and arsenic on PML/RARalpha-expressing cell population with stem cell capacity derived from the APL cell line NB4 as well as Sca1+/lin- murine bone marrow cells. We found that t-RA did not reduce the replating efficiency in PML/RARalpha- and PLZF/RARalpha-infected Sca1+/lincells whereas it selected small compact colonies representing very early progenitor cells. T-RA was unable to reduce the capacity to form colony forming units-spleen (CFU-S) of Sca1+/lin-cells expressing PML/RARalpha, additionally t-RA did not impair the capability of engraftment of NB4 cells in NOD/SCID mouse. On the contrary to t-RA, As2O3 abolished the aberrant self-renewal potential of Sca1+/lin- cells expressing PML/RARalpha. As2O3 not only abolished the replating efficiency of PML/RARalpha positive cells but also completely abrogated the ability of PML/RARalpha-positive HSC to produce CFU-S in vivo. On the contrary to As2O3, t-RA increased the absolute cell number and the percentage of cells in the side population with respect to the whole cell population in NB4 cells. Taken together these data suggest that arsenic but not all-trans retinoic acid overcomes the aberrant stem cell capacity of PML/RARalpha positive leukemic stem cells. My data prove for the first time that there is a direct relationship between the capacity of compounds to effectively target the LSC and their capacity to eradicate the leukemia, and, thereby, to induce complete molecular remission and long-term relapse-free survival. Thus, in order to increase the curative potential of leukemia therapies, future studies need to include the effect of given compounds on the stem cell compartment to determine their ability to eradicate the LSC.
The transporter associated with antigen processing-like (TAPL) acts as a lysosomal ATP-dependent polypeptide transporter with broad length selectivity. To characterize in detail its substrate specificity, a procedure for solubilization, purification and functional reconstitution of human TAPL was developed. TAPL was expressed in Sf9 insect cells with the baculovirus expression system and solubilized from crude membranes. By intensive screening of detergents, the mild non-ionic detergents digitonin and dodecylmaltoside were found to be ideal for solubilization with respect to efficiency, long term stability, and functionality of TAPL. TAPL was isolated in a two-step procedure with a yield of 500 micro g/L cell culture and, subsequently, reconstituted into proteoliposomes. The KM(pep) for the peptide RRYCfKSTEL (f refers to fluorescence label) and KM(ATP) were determined to be 10.5 ± 2.3 micro M and 97.6 ± 27.5 micro M, respectively, which are in the same range as the Michaelis-Menten constants determined in the membranes. The peptide transport activity of the reconstituted TAPL strongly depends on the lipid composition. Interestingly, the E. coli lipids are prefered over other tested natural lipids extracts. Moreover, phosphatidylcholine, the most abundant phospholipid in eukaryotic cells influenced TAPL activity in a dose dependent manner. In addition, some negatively charged lipids like DOPA and DOPS increased peptide transport activity with preference for DOPS. However, DOPE or egg PG which are also negatively charged had no effect. It seems not only the charge but also the specific head group of phospholipids that has impact on the function of TAPL. With the help of combinatorial peptide libraries containing D-amino acid residues at defined positions as well as bulky fluorescein labeled peptides, the key positions of the peptides were localized to the N- and C-terminal residues with respect to peptide transport. The C-terminal position has the strongest selectivity since modification at this position shows strongest impact on peptide transport. Additionally, positions 2 and 3 of the peptide also have weak influence on peptide selectivity. Subsequently, the residue preferences at the key positions were systematically investigated by combinatorial peptide libraries with defined residues at certain positions. At both ends, TAPL favors positively charged, aromatic, or hydrophobic residues and disfavors negatively charged residues as well as asparagine and methionine. The residue preferences at the key positions are valid for peptide substrates with different length, indicating a general rule for TAPL selectivity. Besides specific interactions of both terminal residues, electrostatic interactions are important, since peptides with positive net charge are more efficiently transported than negatively charged ones. By size exclusion chromatography (SEC) and blue native PAGE, TAPL purified in the presence of digitonin or dodecylmaltoside had an apparent molecular weight of 200 kDa which is close to the theoretical molecular mass of the TAPL homodimer (172 kDa). The purified and reconstituted TAPL showed specific ATP hydrolysis activity which can be inhibited by orthovanadate. TAPL in proteoliposomes showed 6-fold higher ATP hydrolysis than digitonin solubilized protein, indicating the phospholipids impact on TAPL function. However, no peptide substrate stimulated ATPase activity was observed. For site-specific labeling of TAPL, eight cysteines in each half transporter were replaced by alanine or valine. The TAPL cys-less mutant showed the same peptide transport activity as TAPL wt. Based on the functional TAPL cys-less mutant, seven single cysteine mutants were introduced into strategic positions. All single cysteine mutants in the TMD did not influence peptide transport, whereas the mutant L701C, which is close to the conserved H-loop motif, displayed impaired transport. TAPL orthologs Haf-4 and Haf-9 from Caenorhabditis elegans possess around 40% sequence identities with TAPL and 50% with each other. Both proteins are putative half transporters and reported to be involved in the intestinal granule formation (Bauer, 2006; Kawai et al., 2009). To further understand the physiological functions of these two proteins, they were expressed in Sf9 insect cells. Haf-4 and Haf-9 showed weak but specific ATP- and peptide-dependent peptide transport activity for the given peptide RRYCfKSTEL. Therefore, it was proposed that the physiological roles for Haf-4 and Haf-9 might be related to their peptide transport activity. Besides forming functional homodimeric complex as estimated by the peptide transport activities, both half transporter could also form heteromers which was confirmed by coimmunoprecipitation. However, the heteromers showed decreased transport activity.
This work presents a biochemical, functional and structural characterization of Aquifex aeolicus F1FO ATP synthase obtained using both a native form (AAF1FO) and a heterologous form (EAF1FO) of this enzyme.
F1FO ATP synthases catalyze the synthesis of ATP from ADP and inorganic phosphate driven by ion motive forces across the membrane and therefore play a key cellular function. Because of their central role in supporting life, F1FO ATP synthases are ubiquitous and have been remarkably conserved throughout evolution. For their biological importance, F1FO ATP synthases have been extensively studied for many decades and many of them were characterized from both a functional and a structural standpoint. However, important properties of ATP synthases – specifically properties pertaining to their membrane embedded subunits – have yet to be determined and no structures are available to date for the intact enzyme complex. Therefore, F1FO ATP synthases are still a major focus of research worldwide. Our research group had previously reported an initial characterization of AAF1FO and had indicated that this enzyme presents unique features, i.e. a bent central stalk and a putatively heterodimeric peripheral stalk. Based on such a characterization, this enzyme revealed promising for structural and functional studies on ATP synthases and became the focus of this doctoral thesis. Two different lines of research were followed in this work.
First, the characterization of AAF1FO was extended by bioinformatic, biochemical and enzymatic analyses. The work on AAF1FO led to the identification of a new detergent that maintains a higher homogeneity and integrity of the complex, namely the detergent trans-4-(trans-4’-propylcyclohexyl)cyclohexyl-α-D-maltoside (α-PCC). The characterization of AAF1FO in this new detergent showed that AAF1FO is a proton-dependent, not a sodium ion-dependent ATP synthase and that its ATP hydrolysis mechanism needs to be triggered and activated by high temperatures, possibly inducing a conformational switch in subunit γ. Moreover, this approach suggested that AAF1FO may present unusual features in its membrane subunits, i.e. short N-terminal segments in subunits a and c with implications for the membrane insertion mechanism of these subunits.
Investigating on these unique features of A. aeolicus F1FO ATP synthase could not be done using A. aeolicus cells, because these require a harsh and dangerous environment for growth and they are inaccessible to genetic manipulations. Therefore, a second approach was pursued, in which an expression system was created to produce the enzyme in the heterologous host E. coli. This second approach was experimentally challenging, because A. aeolicus F1FO ATP synthase is a 500-kDa multimeric membrane enzyme with a complicated and still not entirely determined stoichiometry and because its encoding genes are scattered throughout A. aeolicus genome, rather than being organized in one single operon. However, an artificial operon suitable for expression was created in this work and led to the successful production of an active and fully assembled form of Aquifex aeolicus F1FO ATP synthase. Such artificial operon was created using a stepwise approach, in which we expressed and studied first individual subunits, then subcomplexes, and finally the entire F1FO ATP synthase complex. We confirmed experimentally that subunits b1 and b2 form a heterodimeric subcomplex in the E. coli membranes, which is a unique case among ATP synthases of non-photosynthetic organisms. Moreover, we determined that the b1b2 subcomplex is sufficient to recruit the soluble F1 subcomplex to the membranes, without requiring the presence of the other membrane subunits a and c. The latter subunits can be produced in our expression system only when the whole ATP synthase is expressed, but not in isolation nor in the context of smaller FO subcomplexes. These observations led us to propose a novel mechanism for the assembly of ATP synthases, in which first the F1 subcomplex attaches to the membrane via subunit b1b2, and then cring and subunits a assemble to complete the FO subcomplex. Furthermore, we could purify the heterologous ATP synthase (EAF1FO) to homogeneity by chromatography and electro-elution. Enzymatic assays showed that the purified form of EAF1FO is as active as AAF1FO. Peptide mass fingerprinting showed that EAF1FO is composed of the same subunits as AAF1FO and all soluble and membrane subunits could be identified. Finally, single-particle electron microscopy analysis revealed that the structure of EAF1FO is identical to that of AAF1FO. Therefore, the EAF1FO expression system serves as a reliable platform for investigating on properties of AAF1FO.
Specifically, in this work, EAF1FO was used to study the membrane insertion mechanism of rotary subunit c. Subunits c possess different lengths and levels of hydrophobicity across species and by analyzing their N-terminal variability, four phylogenetic groups of subunits c were distinguished (groups 1 to 4). As a member of group 2, the subunit c from A. aeolicus F1FO ATP synthase is characterized by an N-terminal segment that functions as a signal peptide with SRP recognition features, a unique case for bacterial F1FO ATP synthases. By accurately designing mutants of EAF1FO, we determined that such a signal peptide is strictly necessary for membrane insertion of subunit c and we concluded that A. aeolicus subunit c inserts into E. coli membranes using a different pathway than E. coli subunit c. Such a property may be common to other ATP synthases from extremophilic organisms, which all cluster in the same phylogenetic group.
In conclusion, the successful production of the fully assembled and active F1FO ATP synthase from A. aeolicus in E. coli reported in this work provides a novel genetic system to study A. aeolicus F1FO ATP synthase. To a broader extent, it will also serve in the future as a solid reference for designing strategies aimed at producing large multi-subunit complexes with complicated stoichiometry.
Metabotropic glutamate receptor subtype 7 (mGluR7) belongs to the family of G-protein coupled receptors. mGluR7 is widely distributed in the brain and primarily localized at presynaptic terminals, where it is thought to regulate neurotransmitter release and synaptic plasticity. Studies have shown that the intracellular C-terminal tail of mGluR7 binds a variety of proteins in addition to trimeric G-proteins. These newly identified protein interactions are believed to play a key role in the synaptic targeting and G-protein dependent signaling of mGluR7. Protein interacting with C kinase 1 (PICK1), a PDZ-domain protein, is a strong interaction partner of mGluR7a. In order to investigate the role of PICK1 in the synaptic trafficking and signaling of mGluR7a, a knock-in mouse line in which the interaction of mGluR7a and PICK1 is disrupted was generated. Analysis of the mutant mice by immunocytochemistry and immunoelectron microscopy showed that the synaptic targeting and clustering of mGluR7a was not altered, indicating that PICK1 is not required for mGluR7a receptor membrane trafficking and synaptic localization. However, when the spontaneous synaptic activity of cerebellar granule cell cultures prepared from both wild-type and knock-in mice was monitored, and L-AP4 (400μm) was found to decrease the frequency, but not the amplitude, of spontaneous excitatory currents in wild-type neurons, while no effect of L-AP4 on spontaneous synaptic activity was observed in knock-in neurons. This indicates that PICK1 binding to the C-terminal region of mGluR7a plays an essential role in mGluR7a mediated G-protein signaling. We examined the threshold sensitivity for the convulsant pentetrazole (PTZ) in knock-in mice. It was found that mGluR7a knock-in mice had a greater sensitivity to PTZ than wild-type mice. Moreover, the surface parietal cortex EEG recordings of the mutant mice revealed spontaneous synchronous oscillation, or "spike-and-wave discharges" (SWD), which displayed similar characteristics to absence-like seizures. It was also observed that the knock-in mice responded to pharmacology as human absence epilepsy. These data suggests that the knock-in mice displayed the phenotype of absencelike epilepsy. Furthermore, the behavioral analysis of the mGluR7a knock-in mice showed no deficits in motor coordination, pain sensation, anxiety as well as spatial learning and memory, thus the interaction of mGluR7a and PICK1 appears not to contribute to these physiological processes. Taken together, our data provides evidence for an important role of PICK1 in Gprotein dependent signaling of mGluR7a, whereas PICK1 is not required for synaptic targeting and clustering of mGluR7a. Our results also provide an animal model of absencelike epilepsy generated by disruption of a single mGluR7a-PDZ interaction, thus creating a novel therapeutic target against this neurological disease.
Etablierung, Charakterisierung und Anwendung eines In-vitro-Zellkulturmodells der Blut-Hirn-Schranke
(2001)
Es wurde durch die Optimierung der Isolierung und Kultivierung von cerebralen mikrovaskulären Endothelzellen (BCEC) ein in vitro-Zellkulturmodell der Blut-Hirn-Schranke (BHS) etabliert, das bezüglich seiner Permeabilitäts-Charakteristiken spezifische und herausragende Eigenschaften aufwies. Nach Abschluss der Etablierungs- und Optimierungsphase konnten im bovinen System wiederholt und reproduzierbar transendotheliale elektrische Widerstände (transendothelial electrical resistance, TEER) von zum Teil deutlich oberhalb 1000 Ohm mal cm hoch 2 erzielt werden, und die parazelluläre Permeabilität der bovinen BCEC-Monolayer für Sucrose lag annähernd auf dem niedrigen Niveau hochimpermeabler MDCK-Epithelzell-Monolayer und der entsprechenden in vivo-Parameter. Die per se niedrige Permeabilität des in vitro-BHS-Zellkulturmodells konnte sowohl durch Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels der BCEC als auch durch Kokultur der BCEC-Monolayer mit C6-Glioma- Zellen zusätzlich deutlich verringert werden. In Kombination konnte dabei ein TEER von über 3000 Ohm mal cm hoch 2 erzielt werden, einem Wert, der deutlich über dem TEER cerebraler pialer Kapillaren in vivo (1000-2000 Ohm mal cm hoch 2) liegt und in BHS-Zellkultursystemen bisher nicht einmal annähernd erreicht wurde. Der Vergleich des im Rahmen dieser Arbeit etablierten in vitro-BHS-Modells mit gut etablierten und charakterisierten BHS-Modellen bestätigten eindeutig dessen hohe Qualität und herausragende Eigenschaften. Im Rahmen eines indirekt-Kontakt-Kokultursystems konnte in zahlreichen Experimenten eindeutig und reproduzierbar gezeigt werden, dass eine Kokultur von postkonfluenten bovinen oder humanen BCECMonolayern mit humanen Makrophagen zu einer durch deutliche Erhöhung des TEER nachweisbaren Verringerung ihrer Permeabilität führte. Die bei den BCEC durch die Makrophagen induzierte TEER-Erhöhung war mit der durch die Kokultur mit C6-Glioma-ZeIlen bewirkten vergleichbar. Eine proinflammatorische Stimulation der Makrophagen vor Beginn der Kokultur zeigte keine eindeutige Beeinflussung ihrer Wirkung auf die mit ihnen kokultivierten BCEC-Monolayer. Eine Infektion der Makrophagen mit zwei verschiedenen HIV-1-Isolaten zeigte trotz Vorhandenseins einer produktiven HIV-1-lnfektion keine Auswirkung auf die von ihnen bewirkte TEER-Erhöhung bei den kokultivierten BCEC-Monolayer, es konnten diesbezüglich keine Unterschiede zwischen uninfizierten und infizierten Makrophagen festgestellt werden. Eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels führte bei den mit Makrophagen kokultivierten BCECMonolayern wie bei den mit C6-Glioma-Zellen kokultivierten BCEC-Monolayern zu einer zusätzlichen Steigerung des TEER. Die Inhibition der Adenylat-Cyclase und verschiedener Protein-Kinasen (Protein-Kinasen A, C, G und MLCK) zeigte keine Auswirkung auf die von Makrophagen bewirkte TEER-Erhöhung bei den kokultivierten BCEC-Monolayern; die Aktivierung der Protein-Kinase C führte zu dem gleichen Ergebnis. Die Inhibition der Phospholipase C und der Ca2~-vermittelten Aktivierung des Calmodulins zeigte ebenfalls keine Auswirkung auf die durch die Makrophagen- beziehungsweise C6-Kokultur bewirkte TEER-Erhöhung bei den BCEC-Monolayern. Eine Beteiligung der untersuchten Signaltransduktionswege an dem von Makrophagen oder 06 ausgeübten Einfluss auf die BCEC erscheint somit unwahrscheinlich. Der Befund, dass hämatogene Makrophagen in der Lage sind, bei kultivierten BCEC BHS-spezifische Eigenschaften zu induzieren und/oder aufrechtzuerhalten, ist überaus bemerkenswert, da diese Wirkung bislang ausnahmslos Zellen neuroektodermalen Ursprungs (beispielsweise Astrocyten) sowie glialen Zelllinien zugeschrieben wurde. Hämatogene Makrophagen oder davon abgeleitete Zellen des Hirnparenchyms könnten damit ein Teil der Mikroumgebung sein, die in vivo die charakteristischen Eigenschaften von Hirnendothelzellen modulieren, beispielsweise in Form der perivaskulären Mikrogliazellen, die in engem Kontakt mit den cerebralen Blutgefäßen stehen und höchstwahrscheinlich durch aus dem Blutstrom in das Gehirn einwandernde Monocyten/Makrophagen kontinuierlich ersetzt werden. Das in vitro-BHS-Zellkulturmodell wurde weiterhin für pharmakologische Studien eingesetzt, um den Einfluss von Nanopartikeln, die als potentielle brain targeting-Trägersysteme für Arzneistoffe diskutiert werden, auf die Barriere-Eigenschaften postkonfluenter cerebraler Endothelzellen zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass die Zugabe verschiedener Nanopartikel-Präparationen zu postkonfluenten BCECMonolayern zu einer deutlichen und konzentrationsabhängigen Erhöhung deren Permeabilität für Elektrolyte und makromolekulare Substanzen führte.
Trotz der Verfügbarkeit von siRNA, dem aktuellen Goldstandard zur Generierung von RNAInterferenz-vermitteltem Gen-silencing, stellen unerwünschte Immunantworten des Organismus auf doppelsträngige RNA exogenen Ursprungs noch immer ein fundamentales Problem dar, besonders mit Hinblick auf die Entwicklung Oligonukleotid-basierter Wirkstoffe.
Durch das begrenzte Repertoire an Modifikationen, welches durch die Abhängigkeit von zelleigenen Faktoren unter anderem zur Steigerung der intrazellulären Stabilität und zur Reduktion unerwünschter Effekte zur Verfügung steht, konnte bis dato nur einer überschaubaren Anzahl entsprechender Oligonukleotide eine offizielle Zulassung für die therapeutische Anwendung in der Medizin erteilt werden.
Hier bergen künstliche Ribonukleasen, welche die Umesterungsreaktion unabhängig von der zellinternen Maschinerie ebenfalls effizient und sequenzspezifisch bewerkstelligen können, großes Potential als eine Alternative. Während Metall-basierte Systeme in der Regel auf unphysiologisch hohe Konzentrationen zweiwertiger Übergangsmetallionen, wie beispielsweise Lanthanoide oder auch Kupfer, angewiesen sind, könnten metallfreie Katalysatoren dahingehend eine wesentlich flexiblere Option darstellen. Die Optimierung Guanidin-basierter RNA-Spalter für den Einsatz in der Bioanalytik und Medizin stellt seit geraumer Zeit eines der obersten Ziele unseres Arbeitskreises dar. Unter diesen bewährte sich vor allem das Tris(2-aminobenzimidazol), welches in Form von Konjugaten mit Antisense-Oligonukleotiden kurze Modellsubstrate sequenzspezifisch spaltet.
Neben der äußerst mühseligen, vielstufigen Synthese eines konjugierbaren Tris(2-aminobenzimidazol)s waren die untersuchten Systeme mit Halbwertszeiten von teilweise über 20 Stunden jedoch viel zu langsam, um auch potentiell beobachtbare Veränderung des Phänotyps in vivo induzieren zu können. Ein weiterer begrenzender Faktor stellte die Konjugationstrategie des Spalters über Aktivester-Chemie und Aminolinker dar, welche eine Kupplungsausbeute von 0 % bis im besten Fall ca. 30 % lieferte. Um eine Methode zu erhalten, welche routinemäßig zur sequenzspezifischen Spaltung einer Vielzahl verschiedener RNA-Substrate genutzt werden kann, war folglich eine praktikablere Synthesestrategie zur Darstellung der Spalterkonjugate einerseits und zudem eine Erhöhung der Katalysatoraktivität andererseits notwendig, um auch kurzlebige Ziel-RNAs wirkungsvoll ausschalten zu können. In diesem Zusammenhang wurde eine neue Syntheseroute erarbeitet, welche den für die Konjugation funktionalisierten Spalter über wenige Stufen in Mengen von über 10 g lieferte. Daran anschließend konnte die Synthese eines Phosphoramidits realisiert werden, welches in einer manuellen Kupplungsprozedur die Darstellung von 5‘-Konjugaten des Tris(2-aminobenzimidazol)s in exzellenten Ausbeuten und, im Vergleich zur vorherigen Methode, wesentlich kürzeren Kupplungszeiten ermöglichte. Die vollständige Kompatibilität des Phosphoramidits mit der automatisierten Festphasensynthese konnte im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht erreicht werden. Während die manuelle Prozedur Konjugationsausbeuten von über 90 % lieferte, wurden an einem handelsüblichen Oligonukleotid-Synthesizer auch nach Modifikation der Kupplungsprotokolle und bei erhöhtem Amiditverbrauch lediglich 65 %erzielt. Durch Inkorporation von LNA-Nukleotiden in zwei gegen die PIM1-mRNA gerichtete 15mer DNA-Konjugate ließ sich eine Reduktion der Halbwertszeit von Cy5-markierten 22mer Modellsubstrate auf unter 4 h erreichen, wobei dieses Resultat auch anhand eines 412mer Modellsubstrats und in Gegenwart hoher Phosphatkonzentrationen reproduziert werden konnte. Darüber hinaus wurde die besondere Rolle des closing base pairs, sowohl bezüglich der Selektivität als auch der Kinetik der Spaltung, offensichtlich. Während stärker hybridisierende GC-Basenpaare generell eine hohe Präzision gewährleisteten, trat im Falle von AT-Basenpaaren fraying auf, d. h. es konnte auch innerhalb des vermeintlichen Duplex Spaltung beobachtet werden. Genauere Studien zur Positionierung von LNA-Nukleotiden ergaben bei unmittelbarer Lokalisation am 5‘-Terminus von AT-closing base pairs zwar einen selektivitätssteigernden Effekt, überraschenderweise konnte in diesem Fall jedoch auch eine Inhibierung der Spaltungskinetik festgestellt werden. Durch Verschiebung in die vorletzte Position konnte die Aktivität des Konjugats ohne Präzisionsverlust jedoch wiederhergestellt werden. Erste Experimente zur intrazellulären Stabilität der Spalterkonjugate ergaben quantitative, stufenweise Zersetzung, sowohl des DNA- als auch der Mixmer-Konjugate nach wenigen Stunden, was die Notwendigkeit weiterer stabilitätssteigernder Modifikationen zur Vorbereitung auf in vivo-Experimente impliziert. Auf der Suche nach neuen Spaltern stellte sich vor allem das 2-Aminoimidazol als einer der aussichtsreichsten Kandidaten für genauere Untersuchungen heraus. Das korrespondierende Tris(2-aminoimidazol) konnte über eine Marckwald-Synthese in wenigen Stufen dargestellt werden. Erste Spaltexperimente ergaben vor allem in niedrigen Konzentrationen (10 μM) eine im Vergleich zum Benzimidazol-Analogon vielfach höhere Aktivität. Obwohl die Synthese eines funktionalisierten Bisimidazol-benzimidazols gelang, steht dessen Konjugation mit Oligonukleotiden und deren Aktivitätsbestimmung noch aus.
Nach der Entdeckung und strukturellen Aufklärung des Ribosoms war bekannt, dass neben den Proteinen auch regulatorische RNA Sequenzen für die Steuerung biologischer Prozesse im Organismus verantwortlich sind. Dazu zählt unter anderem das trans-activation responsive element (TAR) aus HIV-1, welches am terminalen 5' Bereich (1-59) aller HIV-1 mRNAs eine identische bulge-loop Struktur ausbildet. Die basale Trans-kription des integrierten HIV Promotors ist in Abwesenheit des viralen trans-activator of transcription (Tat) sehr gering (und abhängig von zellulären Transkriptionsfaktoren). Sobald Tat exprimiert wird, bindet es zusammen mit dem humanen positive trancription elongation factor b (p-TEFb) spezifisch an TAR und aktiviert die Transkriptionsrate des viralen Genoms und die Bildung von volllängen Transkripten drastisch. Die Notwendigkeit der Tat-vermittelten Aktivierung als Grundlage einer funktionierenden HIV Replikation macht dieses System zu einem hoch interessanten Target für eine antivirale HIV Therapie. Basierend auf der Hemmung des Tat/TAR Komplexes wurde in den vergangen Jahren eine Reihe von Verbindungen identifiziert, die zwar in-vitro eine inhibierende Wirkung zeigten, aber keine von ihnen konnte bis jetzt als Therapeutikum Verwendung finden. So wäre die noch ausstehende Entdeckung eines effizienten Tat Antagonisten, der ohne die zelleigene Transkription zu beeinträchtigen eine Reduzierung der Virusreplikation von 80 - 90 % akut infizierter Zellen bewirkt, ein bedeutender Durchbruch in der HIV Forschung. Durch eine längere Behandlung von chronisch infizierten Zellen könnte so die Transkription des viralen Genoms abgeschaltet und dadurch eine Eliminierung latenter HIV Reservoirs ermöglichen werden.
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung neuartiger TAR Liganden, zunächst auf Grundlage eines nicht auf Strukturmodellen beruhenden Ligandenscreenings, gefolgt von einem strukturbasierten Ligandendesign. Bei der Suche nach potentiellen Wirkstoffen, beschränkte man die Auswahl der untersuchten Verbindungen auf Guanidin- und Amidinanaloga. Dazu zählten einfache Guanidinderivate mit unterschiedlichen aromatischen Resten sowie heterocyclische Verbindungen, wie Isochinoline, Chinazoline, Perimidine und Phenanthridine. Die Bindungsaffinitäten dieser Wirkstoffkandidaten in Bezug zu TAR wurden über einen FRET Assay nach Matsumoto[1] bestimmt. Eine Auswahl an Verbindungen wurde zudem über eine NMR Titration charakterisiert (AK Schwalbe). Dadurch konnte beobachtet werden, an welcher Position die Liganden mit der TAR RNA in Wechselwirkung treten. Bei diesen Untersuchungen zählten 1,7-
Diaminochinolin (IC50 = 150 µM), 2,4,6-Triaminochinazolin (IC50 = 40 µM) sowie 6,8-Diaminophenanthridin (IC50 = 15 µM) zu den aktivsten Verbindungen.
Um eine Aussage über die Bindungsposen treffen zu können, wurde mittels HF-docking Methoden die Komplexgeometrie energetisch optimiert. Ausgehend von diesen Bindungsmodellen entwickelte man eine Leitstruktur, die als Grundlage eines strukturbasierten Ligandendesigns diente. Im Fokus stand hierbei die Entwicklung einer GC-Basenpaar erkennenden Untereinheit. Mit 3,5-Diamino-9-methyl-3,4,9,10-tetrahydro-1H-pyrrolo[3,4-b]phenanthridin-8(2H)-on (IC50 = 45 µM) konnte ein Ligand identifiziert werden, der im NMR Titrationsexperiment ausschließlich am Basenpaar G26/C39 von TAR eine Verschiebung der Iminoprotonen induzierte. In einem weiteren Projekt versuchte man eine Selektivitätssteigerung durch simultane Adressierung zweier Bindungsstellen zu erreichen. Nachdem im NMR Experiment gezeigt werden konnte, dass 2,4,6-Triaminochinazolin mit hoher Affinität an zwei verschiedenen Bereichen der RNA bindet, wurden eine Reihe dimerer 2,4,6-Triaminochinazolinderivate mit unterschiedlich langen Linkern hergestellt. Mit diesem Ansatz gelang es den hoch affinen Liganden N6,N6'-(1,4-phenylenbis(methylen))bis(chinazolin-2,4,6-triamin) (IC50 = 150 nM) zu identifizieren.
Die chemische Analyse von 17 abundanten Nordseeschwammarten zeigte, dass die Metabolitenzusammensetzung und -konzentration standortbedingt nur geringfügig schwanken. Den Großteil der Schwammmetaboliten bilden mittelpolare bis polare Substanzen ohne UV-Absorption. Allgemein scheinen in Nordseeschwämmen aromatische und olefinische Verbindungen seltener vorzukommen als in tropischen Arten. Die Chemie der einzelnen Nordseeschwämme ist oft ähnlich und wird von kleinen, stickstoffhaltigen Molekülen dominiert. Ubiquitär verbreitete, vermutlich phylogenetisch alte Substanzen wie Inosin, Allantoin, Homarin und Trigonellin wurden in zahlreichen untersuchten Arten nachgewiesen. Trigonellin und Homarin üben, wie für andere marine Organismen bereits dokumentiert, auch in den Nordseeschwämmen Schutzfunktion gegen Konkurrenten und Fouling-Organismen aus. Die identifizierten Verbindungen weisen darauf hin, dass den mit dem Aminosäure- und Purinstoffwechsel verbundenen Biosynthesewegen eine große Bedeutung in der Naturstoffsynthese der untersuchten Schwammarten zukommt. Diese Vermutung wird dadurch untermauert, dass auch die Bildung von Imidazolen (aus Phakellia ventilabrum isoliert) aus Histidin eng mit dem Purinstoffwechsel verbunden ist. Durch den Abbau von Histidin können wiederum Substanzen entstehen, die als Methyldonatoren in Frage kommen (methylierte Verbindungen, vgl. Pachymatisma johnstonia). Biologische Aktivität wurde anhand von Biotests zur antilarvalen, cytotoxischen, antibakteriellen, enzyminhibitorischen und bewuchshemmenden Wirkung in Extrakten der untersuchten Nordseeschwämme nachgewiesen. Dabei zeigten alle Schwammarten Effekte in mehr als einem Biotest. Diese Untersuchungen bestätigen das Vorkommen biologisch aktiver Substanzen in Schwämmen kaltgemäßigter Habitate und widerlegen damit die Latitudinalhypothese. Unabhängig von der geographischen Breite sind Schwämme weltweit einem selektiven Druck ausgesetzt, der die Entwicklung biologisch aktiver Metaboliten begünstigt. Die Art der Selektionsfaktoren scheint jedoch habitatbedingt unterschiedlich zu sein. Während in wärmeren Gewässern vor allem Prädatoren (Fische) das Überleben der Schwämme beeinflussen, sind in kälteren Gebieten Aufwuchsorganismen und Bakterien von entscheidender Bedeutung. Diese Annahme wird durch die Beobachtung der assoziierten Organismen ebenso unterstützt, wie durch die Tatsache, dass in allen untersuchten Nordseeschwammarten (Esperiopsis fucorum, Phakellia ventilabrum, Leucosolenia complicata, Cliona celata, Pachymatisma johnstonia) Bakterien nachgewiesen werden konnten. Neben den ökologischen Beobachtungen bekräftigt auch die starke antibakterielle Wirkung der Schwammmetaboliten diese Hypothese. Während Toxizität seltener beobachtet wurde, zeigten viele Schwämme auch enzyminhibitorische Wirkung. Zusammenhänge zwischen biologischer Aktivität und morphologischen bzw. taxonomischen Kriterien, Lebensweise, Habitatcharakteristika oder assoziierten Organismen waren nicht durch Clusteranalysen aufzudecken. Es konnten jedoch Unterschiede im Metabolitengehalt und der Art der assoziierten Organismen zwischen langlebigen, großen Kieselschwammarten und kleineren, saisonal wachsenden Kalkschwämmen hervorgehoben werden. Leucosolenia compl icata (Calcarea) ist sowohl qualitativ als auch quantitativ relativ metabolitenarm, biologisch sehr aktiv und mit einer großen Zahl an Bakterien assoziiert. Die Mikroorganismen scheinen für diese Art von größerer Bedeutung zu sein als bei den untersuchten Demospongiae. Einige Kieselschwämme (z.B. Cliona celata, Phakellia ventilabrum) sind besonders metabolitenreich, enthalten weniger Bakterien und verfügen ebenfalls über biologisch aktive Substanzen. Um diese Beobachtungen in einem ökologischen Zusammenhang zu sehen, sind eingehendere Studien, wie sie mit Pachymatisma johnstonia durchgeführt wurden, notwendig. Die Isolierung der Hauptmetaboliten von Pachymatisma johnstonia führte zur Identifizierung der methylierten Substanzen Betain, N,N,N-Trimethyl-ß-alanin, L-6-Bromohypaphorin und dem Pyridinalkaloid Trigonellin. Anhand verschiedener biologischer Tests konnte ein Einblick in die Wirkungsweise und Funktion der aktiven Metaboliten gewonnen werden. Die Aminosäure L-6-Bromohypaphorin und eine noch nicht identifizierte Substanz zeigten starke Enzyminhibition gegenüber einer Protein-Tyrosin-Kinase. L-6-Bromohypaphorin wurde im Pinacoderm unbewachsener Individuen in einer höheren Konzentration nachgewiesen als in Schwämmen mit Bryozoenbewuchs, und spielt demnach vermutlich bei der Abwehr von Fouling-Organismen eine Rolle. Bakterien wurden als Produzenten der aktiven Substanzen ausgeschlossen. Eine Abgabe der Metaboliten nach außen ist eher unwahrscheinlich. Die Extrakte von P. johnstonia zeigten starke antibakterielle Wirkung mit einer Breitbandaktivität, vor allem gegen marine Bakterien. Welche Substanzen für diese Effekte verantwortlich sind, ist nicht bekannt. Eine Hälterung von P. johnstonia war möglich. Ebenso wie Cliona celata passte sich der Schwamm an veränderte abiotische und biotische Faktoren an. Verletztes Gewebe wurde regeneriert und Hauptmetaboliten weiter produziert. Die Synthesetätigkeit von P. johnstonia schwankte, die biologische Aktivität blieb über neun Monate hinweg erhalten. Durch eine Optimierung der Hälterungsbedingungen könnte die Naturstoffproduktion vermutlich konstant gehalten werden. Mit P. johnstonia wurde somit ein gutes Beispiel für die Interaktion zwischen Naturstoffchemie, Ökologie und pharmakologischem Potential bzw. biotechnologischer Nutzbarkeit geliefert. Bedingt durch das Ziel der Arbeit, einen Überblick über die Chemie und biologische Aktivität der Nordseeschwämme zu gewinnen, wurde weniger Augenmerk auf die Isolierung neuer Strukturen gelegt. Im Zuge von intensiveren Studien wäre eine Optimierung der chemischen Methodik anzustreben. Die Aufklärung der in geringerer Konzentration vorkommenden Substanzen könnte hilfreich sein, um den ersten Eindruck der Metabolitenzusammensetzung zu überprüfen. Außerdem wird aufgrund der Biotestergebnisse die Existenz zahlreicher biologisch aktiver Substanzen, vor allem antibiotischer Wirkstoffe, vermutet, deren Isolierung eine Herausforderung darstellt. Besonders interessant ist in diesem Zusammenhang auch die Tatsache, dass bisher sämtliche medizinisch genutzten Antibiotika aus Mikroorganismen stammen, Schwämme aber weltweit über ein hohes antibiotisches Potential verfügen. Dadurch stellt sich erneut die Frage, ob Schwämme tatsächlich selbst in der Lage sind, wirksame Substanzen zu produzieren. Diese Ungewissheit zusammen mit der Tatsache, dass alle aus den Nordseeschwämmen isolierten und identifizierten Verbindungen aus Stoffwechselwegen stammen, die bisher als für Mikroorganismen typisch beschrieben wurden, bietet interessante Ansatzmöglichkeiten für weitere Untersuchungen. Auch wenn Schwämme zu den am besten untersuchten Organismen in der marinen Naturstoffchemie zählen, ist das Wissen im Bereich der chemischen Ökologie noch begrenzt. Um mehr über die Beziehung zwischen Schwämmen und ihrer belebten Umwelt zu erfahren und die Rolle der Naturstoffe dabei aufzudecken, müssen geeignete Untersuchungsmethoden bzw. Biotests etabliert werden. Abbildung 4.1 soll die Bedeutung der Schwämme für ihren Lebensraum und den Menschen hervorheben und die komplexen Zusammenhänge, welche durch die Wirkung der Naturstoffe vermittelt werden, verdeutlichen. Häufig werden Schwämme als primitive Organismen beschrieben, da sie sich durch das Fehlen eines Nervensystems und anderer Organe von höheren Tieren unterscheiden. Tatsächlich sind diese Lebewesen aber hochentwickelte Spezialisten. Optimal an eine sessile Lebensweise angepasst, bewohnen sie seit Millionen von Jahren erfolgreich vor allem marine Habitate in großer Artendiversität und Abundanz. Aufgrund der Produktion von aktiven Metaboliten zur Abwehr schädlicher Organismen stellen die Schwämme aus menschlicher Perspektive eine wertvolle Ressource dar. Nicht nur aus diesem Grund sollten wir Ihnen mit Respekt begegnen und versuchen, die (Naturstoff-)forschung nachhaltig zu betreiben, die Beeinträchtigung der Tiere auf ein vertretbares Maß zu reduzieren und ihren Lebensraum zu schützen.
Modern computational molecular quantum chemical studies, such as the present one, typically employ a wide range of theoretical techniques. The latter are often rather complicated and one should not generally expect that an experimental scientist in the area of physical chemistry, a potential reader of this work, should be familiar with all these techniques. To simplify the reading of the Thesis and to make it self-sufficient, it is supplied with an overview of the employed theoretical methodologies (Chapter 1). The overview explains basic quantum-chemical terminology referred to throughout the Thesis, introduces theoretical foundations of the methods and outlines their properties and limitations. In Part 1.1 of Chapter 1, methods for the solution of the molecular Schrödinger equation are introduced, while in the subsequent Parts 1.2 and 1.3 methods for the solution of the electronic Schrödinger equation are presented to find the ground and excited states, respectively. Part 1.4 is dedicated to basis-set effects which are omnipresent in electronic-structure calculations. It contains a number of unusual insights and concepts proposed by the author and, thus, may be insightful also to experts in quantum chemistry.
In Chapter 2, the phenomenon of acetone-water proton exchange catalyzed by tubular as well as amorphous aggregates of calix[4]hydroquinone (CHQ) macromolecules, which has been observed previously in NMR experiments (Ref. D1D), is investigated by means of correlated quantum-chemical methods. The first part of the study (Section 2.3-2.7) considers concerted proton transfer, assisted by several initially neutral OH-groups in the hydrogen-bonded networks of CHQ aggregates. The second part of the study (Section 2.8-2.13) is dedicated to a second mechanism of proton exchange: step-wise proton transfer via formation of ionic intermediates resulting from CHQ pre-dissociation. CHQ application-specific as well as general conclusions, relevant to the main topic of the Thesis (i.e. influence of specific microsolvation on the considered proton transfer processes), are presented in Section 2.14.
The phenomenon of dual fluorescence observed in clusters of methyl 4-N,N-dimethylaminobenzoate ester (DMABME) and two water molecules in the gas phase, is studied in Chapter 3. Experimentally, the dual fluorescence was detected in experiments combining optical and ground-state ion-depletion infrared spectroscopies in ultracold molecular beams (Ref. D2D). In Section 3.3, calculated ground-state infrared spectra are presented that allow to identify the structures of those isomers, which are present in the gas-phase, as well as the structure of the isomer responsible for dual fluorescence. To further understand the reaction mechanism of dual fluorescence, excited-state potential energy surfaces of the identified isomers were computed along the relevant twisted intermolecular charge-transfer formation coordinate and the mechanism of energy dissipation in these complexes was investigated (Section 3.4-3.5) (Ref. D3D). A brief summary of the main results of this chapter and conclusions are given in Section 3.6. Finally, in Section 3.7 a complementary benchmark study of the quality of ground-state potential energy surfaces of prototypical hydrogen-bonded systems (ammonia-water and formic acid-water dimers) obtained at the level of BSSE-corrected MP2 combined with moderate basis sets, has been conducted. The quality of potential energy surfaces was tested with respect to basis-set size, level of electron correlation and anharmonicity effects and the applied methodology to identify the IR spectrum of hydrated DMABME complexes (Section 3.3) has been found to be sufficient to uniquely assign the IR spectra.
Nucleotide-binding domains (NBDs), roughly 27 kDa in size, are conservative components of the large family of ABC (ATP-binding cassette) transporters, which includes importers, exporters, and receptors. NBDs or ABC-ATPases supply energy for the translocation of a vast variety of substrates across biological membranes. Despite their hydrophilic sequence, many NBDs tend to aggregate and precipitate in solution upon isolation from the complete transporter. The conditions stabilizing an extremely labile NBD component of the E.coli HlyA transporter, HlyB-NBD, were developed. As a result, the pure highly concentrated enzyme was protected from precipitation for months that allowed screening of the unlimited crystallization conditions in the presence of different substrates and performance of the reproducible functional assays. HlyB-NBD was characterized in regard to its uncoupled ATPase activity, oligomeric state, and stability in solution. Comparative analysis of protein stability and ATPase activity in various buffers suggested an inverse relationship between the two. Kinetic analysis of ATPase activity revealed ATP-induced protein dimerization. Gel-filtration experiments with the wild type protein and H662A-mutant of HlyB-NBD provided further evidence of protein dimerization in the presence of ATP. The crystal structures in post- and pre-hydrolysis nucleotide-bound states of HlyB-NBD were determined at 1.6Å and 2.5Å resolution, respectively. While the hydrolytically deficient H662A mutant of HlyB-NBD was crystallized as a stable dimer in the presence of ATP or ATP-Mg2+, with two nucleotide molecules sandwiched between the two monomers, the same protein was shown to be a monomer in the ADP-loaded state. The wild type protein failed to develop crystals with bound ATP, yet formed ADP-bound crystals identical to those of the H662A-mutant. The X-ray structures of HlyB-NBD in various states of the hydrolytic cycle and the functional studies of the enzyme have provided an opportunity to characterize enzyme-substrate complexes and protein-protein interactions between the NBD subunits in great detail. Comparison of the nucleotide-free, the ADP-, and the ATP-loaded states revealed oligomeric and conformational changes of the protein upon substrate binding and resulted in a molecular picture of the catalytic cycle. The correlated results of the structural and functional investigations of HlyB-NBD are discussed with relation to the mechanism of action of ABC transporters.
Die antivirale Funktion der RNA-abhängigen Adenosin-Desaminase bei der angeborenen Immunantwort
(2004)
Die angeborene Immunantwort von Säugetieren ist die erste wirkungsvolle Barriere gegen eindringende Pathogene, die sowohl Infektionen als auch die Entstehung von Neoplasien verhindern kann. Insbesondere wird durch sie die Ausbreitung und Replikation von Viren wirksam bekämpft. Bei RNA-Viren wird die angeborene Immunabwehr in infizierten Zellen von der doppelsträngigen RNA aktiviert, die während der Replikation oder Transkription dieser Viren entsteht. Es kommt zur Sezernierung von Interferon-alpha und -beta (IFN-alpha/beta), die wiederum die Expression einer Reihe von antiviralen Proteinen stimulieren. Eines dieser Proteine ist die IFN-alpha-induzierbare RNA-abhängige Adenosin Desaminase (iADAR-1). Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der iADAR-1 in der Immunabwehr näher zu charakterisieren. Bisher wurde die antivirale Aktivität der iADAR-1 gegen verschiedene Virusstämme, deren Genome Adenosin zu Guanosin (A->G) Hypermutationen aufweisen, nur angenommen, jedoch noch nicht direkt gezeigt [4]. In dieser Arbeit wurde am Beispiel des Glykoproteins (GP) des lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) untersucht, ob solche A->G Mutationen im viralen Genom tatsächlich durch die iADAR-1 verursacht werden und ob dadurch die Funktion der viralen Proteine und damit die Infektiösität von LCMV reduziert wird. Des Weiteren wurde die Induktion der iADAR-1 durch die Infektion mit LCMV und die Wirkung der iADAR-1 auf die Replikation von LCMV analysiert. Bekannt war nur, dass die iADAR-1 durch IFN-alpha selbst oder durch die Infektion von Makrophagen mit Adenoviren induziert wird. In dieser Arbeit wurde erstmals für Fibroblasten, neuronale Zellen und in vivo in Mäusen nachgewiesen, dass die iADAR-1 direkt durch die Infektion mit LCMV hochreguliert wird. Dies ist ein weiterer Hinweis, dass die iADAR-1 zu den antiviralen Effektormolekülen der angeborenen Immunabwehr zählt. LCMV induzierte die Expression der iADAR-1 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. Im Gegensatz zu Vaccinia- und Adenoviren, die die Aktivität der iADAR-1 inhibieren [5, 6], konnte bei der Infektion von SH-SY5Y-Zellen mit LCMV keine reduzierte Aktivität der iADAR-1 festgestellt werden. Ferner konnte das schon in anderen Viren beobachtete A->G Hypermutationsmuster nun auch für LCMV bestätigt werden. Sowohl in vitro in L929-Zellen als auch in vivo in Mäusen wurde eine erhöhte A->G Mutationsfrequenz gefunden, die zwischen 50 und 75 % aller Mutationen in der S-RNA von LCMV ausmacht. Dies zeigte sich vor allem in der späten Phase der Infektion, also zu Beginn der Persistenz. Insgesamt wurden zu diesem Zeitpunkt in L929-Zellen 27 % und in der Maus 15 % nicht funktionelles LCMV-GP synthetisiert. Zudem wurde die Relevanz der A->G Hypermutationen für die beeinträchtigte Funktion des GPs deutlich, da sie 62 % der nicht infektiösen GP-Moleküle verursachen. Die desaminierende Wirkung der iADAR-1 auf das virale Genom von LCMV wurde in 293T-Zellen direkt gezeigt. A->G Mutationen in der S-RNA von LCMV nahmen durch die Überexpression der iADAR-1 in 293T-Zellen um 40 % zu. Ebenso wurde die Replikation bzw. das Assembly von Virionen durch die iADAR-1 reduziert, da im Vergleich zu Kontrollzellen der LCMV-Titer im Überstand von iADAR-1-überexprimierenden Zellen wesentlich niedriger war. Des Weiteren konnte bestätigt werden, dass die A->G Mutationen nicht durch die virale Polymerase induziert werden. Hierfür wurden iADAR-1 „knockout“ murine embryonale Fibroblasten (MEF) isoliert und als stabile Zelllinie etabliert. In diesen Zellen war kein A->G Hypermutationsmuster in der LCMV-RNA zu erkennen. In MEF wt war ebenfalls kein A->G Hypermutationsmuster nachweisbar. Der Grund hierfür könnte die im Vergleich zu L929-Zellen deutlich geringere basale iADAR-1-Expression der nicht völlig ausdifferenzierten MEFs sein.
Prostaglandin E2 is the major prostaglandin involved in colorectal carcinogenesis. The biosynthesis of prostaglandin E2 is accomplished by several terminal prostaglandin E synthases through catalytical conversion of the cyclooxygenase product prostaglandin H2. Among the known terminal prostaglandin E synthases, microsomal prostaglandin E synthase type 1 and type 2 were found to be overexpressed in colorectal cancer, however the role and regulation of these enzymes in this tumor entity are yet not fully understood. Here we report that the cyclopentenone prostaglandins 15-deoxy-D12,14-prostaglandin J2 and prostaglandin A2, which have been shown to modulate cell growth and neoplasia, selectively down-regulate microsomal prostaglandin E synthase type 2 mRNA and protein expression in the human colorectal carcinoma cell lines Caco-2 and HCT 116. This effect appeared to be PPARgamma independent and was not found to require G-protein-coupled receptor activation. Instead, inhibition of microsomal prostaglandin E synthase type 2 by cyclopentenone prostaglandins may be mediated by covalent binding of the cyclopentenone ring to cysteine residues on signalling molecules or via a redox-dependent mechanism. Inhibition of microsomal prostaglandin E synthase type 2 was subsequently followed by decreased prostaglandin E synthase activity, which in turn contributed at least in part to the anti-proliferative action of cyclopentenone prostaglandins in HCT 116 cells. Collectively, these data unravel a novel mechanism for the growth-inhibitory effects of cyclopentenone prostaglandins and expose microsomal prostaglandin E synthase type 2 as a new potential target for pharmacological intervention in the treatment of colorectal cancer.
Metal-organic frameworks (MOFs) have emerged as a promising class of crystalline porous inorganic-organic hybrid materials showing a wide range of applications. In order to realize the integration of MOFs into specific devices, this thesis mainly focuses on the controlled growth and the properties of highly oriented surface-mounted metal-organic frameworks (SURMOFs).
The stepwise layer-by-layer (LbL) growth method exhibits vast advantages for the controllable growth of SURMOFs regarding the crystallite orientation, film thickness and homogeneity. However, up to date, only a few MOFs have been demonstrated to be suited for this protocol. So the first project of this thesis was designed to extend the applicability of the LbL growth. To this end, a semi-rigid linker based [Cu2(sdb)2(bipy)] (sdb = 4,4’-sulfonylbiphenyl dicarboxylate; bipy = 4,4’-bipyridine) MOF was chosen. Employing the LbL growth, [Cu2(sdb)2(bipy)] SURMOFs were successfully grown onto both pyridyl- and carboxyl-terminated surfaces at the temperature range of 15-65 °C. Interestingly, the orientation of the SURMOFs largely depends on temperature on both surfaces. At low temperatures (below 40 °C), SURMOFs with exclusive [010] orientation are obtained. In contrast, at high temperatures (40-65 °C), [001] oriented SURMOF growth is favored. A novel growth mode was demonstrated, which is, instead of surface chemistry, the temperature-induced ripening processes and the tendency to minimize surface energies can dominate the SURMOF growth.
Inspired by the advantages of LbL deposition of isoreticular SURMOFs, the second project was conceived to grow multivariate SURMOFs (MTV-SURMOFs) using mixed dicarboxylate linkers. We advance a hypothesis that linker acidity (expressed by the pKa values) may have an influence on the oriented growth of MTV-SURMOFs. To test the hypothesis, seven isoreticular [Cu2L2(dabco)] (L = single kind of dicarboxylate linker; dabco = 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane) SURMOFs were grown onto pyridyl-terminated surfaces at 60 °C. The quality of [001] orientation is greatly affected by the acidity of the linkers. With this observation, we deposited a series of [Cu2Lm2(dabco)] (Lm = mixed dicarboxylate linkers) SURMOFs under the same conditions. [Cu2Lm2(dabco)] SURMOFs with exclusive [001] orientation are obtained when the growth solution contains two linkers of relatively high pKa value or more than two kinds of linkers (independent of the pKa values), while the mixtures of ligands with relatively low pKa values or a high content of low pKa valued linkers can result in mis-oriented growth of SURMOFs with unexpected [100] orientation.
Moreover, the LbL growth shows enormous potential in the rational construction of functional SURMOFs. Therefore, the third project of this thesis was devised to deposit SURMOFs containing redox-active species. For this, the 4,4’-biphenyldicarboxylic acid (H2(bpdc)) linker was functionalized with ferrocene (Fc) and dimethyl ferrocene (Me2Fc) moieties. [Cu2(bpdc-amide-Fc)2(dabco)] SURMOF (Fc-SURMOF) is perfectly grown along the [100] direction, while mis-oriented growth of [Cu2(bpdc-amide-Me2Fc)2(dabco)] SURMOF (Me2Fc-SURMOF) was observed. Surprisingly, Fc-SURMOF shows excellent electrochemical properties due to the reversible oxidation and reduction of the ferrocene moieties in the oriented pores, while the Me2Fc-SURMOF was found to be a closely packed insulating layer since no extensive charge transfer is observed. A diffusion controlled mechanism of redox reaction is proposed, where the diffusion of the counter anions in the pores limits the current.
Besides the LbL growth protocol, the spin-coating technique is also promising for the oriented growth of SURMOFs. Driven by the specific applications, the fourth project of this thesis was planned to grow functional SURMOFs containing catalytically active units. The Keggin-type polyoxometalates (POMs) with high catalytic activities were chosen to functionalize the HKUST-1 SURMOFs. Combining the technique with methanol vapor induced growth, a series of POM functionalized HKUST-1 SURMOFs (denoted as POM@HKUST-1 SURMOFs) were controllably deposited onto pyridyl-terminated surfaces. The SURMOFs exhibit great potential as electrocatalysts in electrochemical devices due to the excellent redox properties of POMs. In addition, the PTA@HKUST-1 (PTA = phosphotungstic acid) SURMOF can be employed as an ideal platform for the selective loading of methylene blue (MB) dye with high efficiency. Owing to the strong binding between the dye molecules and the framework, the MB dye cannot be desorbed by ion exchange and MB loaded PTA@HKUST-1 SURMOF shows reliable redox properties under inert conditions, further confirming the application potential in electrochemical devices.
In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, OTS-, MPTMS-, und MPTMS/OTS gemischte SAMs aus der Lösung auf SC-1 chemisch oxidierten Siliziumwafern („SiO2“) zu präparieren. Die Adsorption der OTS oder MPTMS SAMs auf SiO2 wird von zwei konkurrierenden Reaktionen bestimmt, d.h. „Selbstaggregation” in der Ausgangslösung und “Oberflächendehydration” des SiO2 -Substrates. Die beiden Alkylsiloxan-SAMs weisen unterschiedliches Bildungsverhalten auf. Die Reifungsdauer der Ausgangslösung vor der Adsorption wirkt sich signifikant auf die Bildung der OTS SAMs aus, demgegenüber ist bei MPTMS SAMs kein Einfluß zu beobachten. Für OTS SAMs sind große Dendriten oftmals von kleinen Rundinseln umgeben, dagegen für MPTMS SAMs treten prinzipiell nur sporadisch verteilte kleine Rundinseln auf. Die Abwesenheit des Chlor-Signals in XPS-Spektren bestätigt, dass innerhalb der Adsorption die Si-Cl Bindungen der OTS-Moleküle zum größten Teil hydrolysiert werden. Doch für MPTMS SAMs ist in C 1s-Spektren ein Peak bei 286.4 eV, der der unhydrolysierten Si-OCH3 Bindung entspricht, zu beobachten. Die Hydrolysefähigkeit der Si-Cl Bindung des OTS ist erwartungsgemäß stärker als jene der Si-OCH3 Bindung des MPTMS. Diese Tendenz samt dem Unterschied in der Alkylkettenlänge wirkt sich beträchtlich auf die Bildung und die Morphologie der adsorbierten Inseln aus. Bei gleicher Konzentration (5 mM) und Reifungsdauer der Ausgangslösung bilden sich OTS SAMs viel schneller als MPTMS SAMs bei Raumtemperatur. Sie hat auch eine größere Oberflächenbedeckung wegen der seitlichen Vernetzung zur Folge. Diese Beobachtung zeigt eine prognostizierbare kinetische Schwierigkeit zur Präparation der OTS/MPTMS gemischten SAMs durch Koadsorption. Grund hierfür ist, dass die Adsorption voraussichtlich von OTS-Molekülen dominiert wird. Darüber hinaus ist Aggregation zwischen hydrolysierten OTS- und MPTMS-Molekülen nicht ausgeschlossen. Neben der Koadsorption steht in der zweistufigen Adsorption ein weiteres herkömmliches Verfahren zur Verfügung. Das Endprodukt kann nach der Reaktionsreihe der Silane mit „OTS+MPTMS“ oder „MPTMS+OTS“ gemischte SAMs bezeichnet werden. Unter Berücksichtigung der individuellen Oberflächenbedeckung und Morphologie wurde eine Rezeptur aufgestellt, in der die Adsorption jeweils höchstens 30s (für OTS) und 20 min (für MPTMS) dauert. Angesichts der vielfältigen Inselstruktur, d.h. Monoschicht, polymerisierte Bälle, und sogar Multischicht, ist eine Phasenunterscheidung nach der Dicke, z.B. mittels AFM, nicht zu erwarten. Die Existenz der lateralen unvernetzten Si-OH Gruppen der adsorbierten OTS-Inseln könnte die Präparation der homogenen OTS+MPTMS gemischten SAMs erschweren. In diesem Fall ist es fraglich, ob die hydrolysierten MPTMS-Moleküle vollständig wie geplant mit oberflächnahen OH-Gruppen von SiO2 reagieren. Mit einer umgekehrten Reaktionsreihe löst sich das Problem von selbst, da die adsorbierten MPTMS-Inseln hauptsächlich unhydrolysierte seitliche Si-OCH3 Gruppen besitzen. Die morphologische Erkennbarkeit unterstützt die Machbarkeit der Präparation der MPTMS+OTS gemischten SAMs. Die unterschiedlichen Messmodi des AFM, mit denen die Morphologie der OTS SAMs aufgenommen wurde, ergaben deutliche Unterschiede in ihrem Erscheinungsbild. Im Vergleich zum Tappingmodus sind die Grenzen der OTS-Inseln auf Kontaktmodus-Bildern nur undeutlich erkennbar. Die großen Inseln erscheinen nicht so dendritisch. Die Ursache dieser Phänomene könnte am Wassermeniskus zwischen Spitze und Probe liegen, da die Messung nicht in Flüssigkeit, sondern an Luft durchgeführt wurde. Auf LFM-Bildern sind die adsorbierten OTS-Inseln heller als unbedecktes SiO2, während die MPTMS-Inseln dunkler als SiO2 aussehen. Eine ähnliche Auswirkung der Messmodi auf die Morphologie der MPTMS SAMs wurde nicht beobachtet. Durch die Adsorption von 1-Decanthiol lässt sich die Si3N4-AFM-Spitze modifizieren. Eine solche CH3-terminierte Spitze ist hydrophob und verursacht einen gegenteiligen Helligkeitskontrast auf LFM-Bildern der adsorbierten OTS-Inseln.
Heme-copper oxidases (HCOs) are the terminal enzymes of the aerobic respiratory chain in the inner mitochondrial membrane or the plasma membrane in many prokaryotes. These multi-subunit membrane protein complexes catalyze the reduction of oxygen to water, coupling this exothermic reaction to the establishment of an electrochemical proton gradient across the membrane in which they are embedded. The energy stored in the electrochemical proton gradient is used e.g. by the FOF1-ATP synthase to generate ATP from ADP and inorganic phosphate. The superfamily of HCOs is phylogenetically classified into three major families: A, B and C. The A-family HCOs, represented by the well-studied aa3-type cytochrome c oxidases (aa3-CcOs), are found in mitochondria and many bacteria. The B-family of HCOs contains a number of bacterial and archaeal oxidases. The C-family comprises only the cbb3-type cytochrome c oxidase (cbb3-CcO) and is most distantly related to the mitochondrial respiratory oxidases.
Das Hauptziel dieser Dissertation lag in der Verbesserung einzelner Schritte im Prozess der automatischen Proteinstrukturbestimmung mittels Kernmagnetischer Resonanz (NMR). Dieser Prozess besteht aus einer Reihe von sequenziellen Schritten, welche zum Teil bereits erfolgreich automatisiert wurden. CYANA ist ein Programmpaket, welches routinemäßig zur automatischen Zuordnung der chemischen Verschiebungen, der Nuclear Overhauser Enhancement (NOE) Signalen und der Strukturrechnung von Proteinen verwendet wird. Einer der Schritte, der noch nicht erfolgreich automatisiert wurde, stellt die Signalidentifizierung von NMR Spektren dar. Dieser Schritt ist besonders wichtig, da Listen von NMR-Signalen Grundlage aller Folgeschritte sind. Fehler in den Signallisten pflanzen sich in allen Folgeschritten der Datenauswertung fort und können am Ende in falschen Strukturen resultieren. Daher war ein Ziel dieser Arbeit, einen robusten und verlässlichen Algorithmus zur Signalidentifizierung von NMR Spektren in CYANA zu implementieren. Dieser Algorithmus sollte mit dem in FLYA implementierten Ansatz zur automatischen Resonanzzuordnung, der automatischen NOE-Zuordnung und der Strukturrechnung mit CYANA kombiniert werden. Der in CYANA implementierte CYPICK Algorithmus ahmt den von Hand durchgeführten Ansatz nach. Bei der manuellen Methode schaut sich der Wissenschaftler zweidimensionale Konturliniendarstellungen der NMR Spektren an und entscheidet anhand verschiedener Geomtrie- und Ähnlichkeitskriterien, ob es sich um ein Signal des Proteins oder um einen Artefakt handelt. Proteinsignale sind ähnlich zu konzentrischen Ellipsen und erfüllen bestimmte geometrische Kriterien, wie zum Beispiel ungefähr kreisförmiges Aussehen nach entsprechender Skalierung der spektralen Achsen und gänzlich konvexe Formen, die Artefakte nicht aufzeigen. CYPICK bewertet die Konturlinien lokaler Extrema nach diesen Bedingungen und entscheidet anhand dieser, ob es sich um ein echtes Signal handelt oder nicht. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es ein Maß zur Quantifizierung der Information von strukturellen NMR Distanzeinschränkungen zu entwickeln. Der sogenannte Informationsgehalt (I) ist vergleichbar mit der Auflösung in der Röntgenkristallographie. Ein weiteres Projekt dieser Dissertation beschäftigte sich mit der strukturbasierten Medikamentenentwicklung (SBDD). SBDD wird meist von der Röntgenkristallographie durchgeführt. NMR hat jedoch einige Vorteile gegenüber der Röntgenkristallographie, welche interessant für SBDD sind. Daher wurden Strategien entwickelt, die NMR für SBDD zugänglicher machen sollen.
1. Fab co-complexes of proton pumping NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) Fab fragments suitable for co-crystallization with complex I were generated using an immobilized papainbased protocol. The binding of the antibody fragments to complex I was verified using Surface Plasmon Resonance and size exclusion chromatography. The binding constants of the antibodies and their respective Fab fragments were found to be in the nanomolar range. This work presents the first report on successful crystallization of complex I (proton pumping NADH:ubiquinone oxidoreductase) from Yarrowia lipolytica with proteolytic Fab fragments. The quality of the crystals was significantly improved when compared to the initial experiments and the best crystals diffracted X-rays to a resolution of ~7 Å. The activity of complex I remained uninfluenced by antibody fragment binding. The initial diffraction data suggest that the complex I/Fab co-complex crystals represent a space group different to the one observed for the native protein. Ongoing experiments are aimed at further enhancements of the diffraction quality of the crystals. Providing a different space group the CI/Fab co-complexes may become a very useful approach for structure determination of the enzyme. Moreover, the bound Fab offers an additional possibility to generate phase information. The antibody-mediated crystallization represents a valuable tool in structural characterization of the NADH:oxidoreductase subcomplexes or even single subunits. 2. UDP-glucose pyrophosphorylase UDP-glucose pyrophosphorylase from Yarrowia lipolytica displays affinity towards Ni2+ NTA and was first detected in a contaminated sample of complex I. Following, separation from complex I, Ugp1p was purified using anion exchange chromatography. Sequence similarity studies revealed high identity to other known pyrophosphorylases. As indicated by laser-based mass spectrometry method (LILBID) Ugp1p from Y. lipolytica builds octamers similarly to the enzyme from Saccharomyces cerevisiae. The initial crystals grew as thin needles favorably in sitting drop setups. The size of the crystals was increased by employment of a micro batch technique. The improved crystals diffracted X-rays to a resolution of 3.2 Å at the synchrotron beamline. Structural characterization is under way using a molecular replacement approach based on the published structure of baker’s yeast UGPase.
Photo-initiated processes, like photo-excitation and -deexcitation, internal conversion, excitation energy transfer and electron transfer, are of importance in many areas of physics, chemistry and biology. For the understanding of such processes, detailed knowledge of excitation energies, potential energy surfaces and excited state properties of the involved molecules is an essential prerequisite. To obtain these informations, quantum chemical calculations are required. Several quantum chemical methods exist which allow for the calculation of excited states. Most of these methods are computationally costly what makes them only applicable to small molecules. However, many biological systems where photo-processes are of interest like light-harvesting complexes in photosynthesis or the reception of light in the human eye by rhodopsin are quite large. For large systems, however, only few theoretical methods remain applicable. The currently most widely used method is time-dependent density functional theory (TD-DFT), which can treat systems of up to 200–300 atoms with the excitation energies of some excited states exhibiting errors of less than 0.5 eV. Yet, TD-DFT has several drawbacks. The most severe failure of TD-DFT is the false description of charge transfer states which is particularly problematic in case of larger systems where it yields a multitude of artificially low-lying charge transfer states. But also Rydberg states and states with large double excitation character are not described correctly. Still, if these deficiencies are kept in mind during the interpretation of results, TD-DFT is a useful tool for the calculation of excited states. In my thesis, TD-DFT is applied in investigations of excitation energy and electron transfer processes in light-harvesting complexes. Since light-harvesting complexes, which consist of thousands of atoms, are by far too large to be calculated, model complexes for the processes of interest are constructed from available crystal structures. The model complexes are used to calculate potential energy curves along meaningful reaction coordinates. Artificial charge transfer states are corrected with the help of the so-called ∆DFT method. The resulting potential energy curves are then interpreted by comparison with experimental results. For the light-harvesting complex LH2 from purple bacteria the experimentally observed formation of carotenoid radical cations is studied. It is shown that the carotenoid radical cation is formed most likely via the optically forbidden S1 state of the carotenoid. In light-harvesting complex LHC-II of green plants the fast component of the so-called non-photochemical quenching (NPQ) is investigated. Two of several different hypotheses on the mechanism of NPQ, which have been proposed recently, are studied in detail. The first one suggests that NPQ proceeds via simple replacement of violaxanthin by zeaxanthin in the binding pocket in LHC-II. However, the calculated potential energy curves exhibit no difference between violaxanthin and zeaxanthin in the binding pocket. In combination with experimental results it is thus shown that simple replacement alone does not mediate NPQ in LHC-II. The second hypothesis proposes conformational changes of LHC-II that lead to quenching at the central lutein and chlorophyll molecules during NPQ. My TD-DFT calculations demonstrate that if this mechanism is operative, only the lutein 1 which is one of two central luteins present in LHC-II can take part in the quenching process. This is corroborated by recent experiments. Though several conclusions can be drawn from the investigations using TD-DFT, the interpretability of the results is limited due to the deficiencies of the method and of the models. To overcome the methodological deficiencies, more accurate methods have to be employed. Therefore, the so-called algebraic diagrammatic construction scheme (ADC) is implemented. ADC is a widely overlooked ab initio method for the calculation of excited states, which is based on propagator theory. Its theoretical derivation proceeds via perturbation expansion of the polarization propagator, which describes electronic excitations. This yields separate schemes for every order of perturbation theory. The second order scheme ADC(2), which is employed here, is the equivalent to the Møller-Plesset ground state method MP(2), but for excited states. It represents the computationally cheapest excited state method which can correctly describe doubly excited states, as well as Rydberg and charge transfer states. The quality of ADC(2) results is demonstrated in calculations on linear polyenes which serve as model systems for the larger carotenoid molecules. The calculations show that ADC(2) describes the three lowest excited states of polyenes sufficiently well, particularly the optically forbidden S1 state which is known to possess large double excitation character. Yet, the applicability of the method is limited compared to TD-DFT due to the much larger computational requirements. To facilitate the calculation of larger systems with ADC(2) a new variant of the method is developed and implemented. The variant employs the short-range behavior of electron correlation to reduce the computational effort. As a first step, the working equations of ADC(2) are transformed into a basis of local orbitals. In this basis negligible contributions of the equations which are due to electron correlation can be identified based on the distances of local orbitals. A so-called “bumping” scheme is implemented which removes the negligible parts during a calculation. This way, the computation times as well as the disk space requirements can be reduced. With the “bumping” scheme several new parameters are introduced that regulate the amount of “bumping” and thereby the speed and the accuracy of computations. To determine useful values for the parameters an evaluation is performed using the linear polyene octatetraene as test molecule. From the evaluation an optimal set of parameter values is obtained, so that the computation times become minimal, while the errors in the excitation energies due to the “bumping” do not exceed 0.15 eV. With further calculations on various molecules of different sizes it is tested if these parameter values are universal, i.e. if they can be used for all molecules. The test calculations show that the errors in the excitation energies are below 0.15 eV for all test systems. Additionally, no trend is visible for the errors that their magnitude might depend on the system. In contrast, the amount of disregarded contributions in the calculations increases drastically with growing system size. Thus, the local variant of ADC(2) can be used in future to reliably calculate excited states of systems which are not accessible with conventional ADC(2).
Die Arachidonsäurekaskade spielt bei Entzündungsprozessen und der Schmerzentstehung eine wichtige Rolle. Deren primäre Produkte, die Leukotriene und die Prostaglandine, sind entzündungsfördernde Mediatoren und nehmen Einfluss auf den Entzündungs-auflösendenprozess und sind bei einer Dysregulation für diverse Erkrankungen wie z.B. Asthma bronchiale und allergische Rhinitis mitverantwortlich. Die Kaskade gliedert sich mit ihren beiden Hauptenzymen, Cyclooxygenase und 5-Lipoxygenase (5-LO), in zwei Wege auf. Beide Enzyme sind außerdem in der Lage entzündungsauflösenden Mediatoren zu bilden. Die Mediatoren wie z.B. Lipoxin können im Zellstoffwechsel einerseits über die Lipoxygenase-Route, oder andererseits wie „aspirin-triggered“-Lipoxin von der durch geeignete Wirkstoffe acetylierten Cyclooxygenase-2 (COX-2) katalysiert werden. Diese Mediatoren werden benötigt, um (chronische) Entzündungen und beschädigtes Gewebe zurück zur Homöostase zu führen.
Die Pharmakotherapie chronisch entzündlicher Erkrankungen mit guter Wirksamkeit und verträglichem Profil bei Langzeiteinnahme stellt jedoch eine Herausforderung dar. Die Therapie verzögern oft, z. B bei Einnahme von nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR), die Entzündungsauflösung, da die Bildung von entzündungshemmenden und entzündungs-auflösenden Lipidmediatoren gehemmt werden. Die gezielte Modulation und Einflussnahme auf die Arachidonsäurekaskade an einem der beiden Enzyme, stellt daher einen guten Ansatz für eine verbesserte Therapiemöglichkeit von (chronischen) entzündlichen Krankheiten dar. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese von Modulatoren und Inhibitoren der Arachidonsäurekaskade. Zum einen befasst sie sich mit der Entwicklung von irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen als neues anti-entzündliches und entzündungsauflösendes Prinzip. Zum anderen mit der Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehung (SAR) von 2-Aminothiazolen als direkte 5-LO-Inhibitoren ausgehend von SKI-II, welches zuvor als Leitstruktur zur Entwicklung von 5-LO-Inhibitoren entdeckt wurde.
Als Leitstrukturen für die irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen wurden bekannte COX-2 selektive Substanzen ausgewählt sowie vereinzelte nicht-selektive NSAR. Es wurden an der COX-2 Kristallstruktur Docking-Studien durchgeführt, um die geeignetsten Positionen für die Einführung einer (labilen) Acetylgruppe zu identifizieren. Aufgrund dieser Studien wurden drei Positionen ausgewählt zur Derivatisierung. Es wurden daraufhin zahlreiche Derivate synthetisiert von Celecoxib, Valdecoxib, Rofecoxib, Etericoxib, als Vertreter der (COX-2) selektive Inhibitoren, sowie von Acetylsalicylsäure, Diclofenac und Nimesulid-Analoga als Vertreter der nicht-selektiven NSARs. Zusätzlich wurden Derivate synthetisiert mit Michael-Akzeptoren als kovalente bindende Komponente. Alle synthetisierten Substanzen wurden sukzessiv auf ihre COX inhibitorischen Eigenschaften hin untersucht und auf COX-2 Selektivitäten überprüft. Weiterhin wurden von allen Derivaten Auswaschungs-Studien durchgeführt als Vorversuche welche Derivate eine irreversible COX-2-Inhibition hervorrufen. In den Vorversuchen zeigte die Verbindung ST-1650 am deutlichsten eine COX-2-Selektivität sowie eine starke irreversible Inhibition der COX-2. Die Verbindung ST-1650 wurde weiterhin auf indirekte Hinweise zur Entstehung von heilungsfördernden Mediatoren untersucht anhand von: M1-Macrophagen Polarisation und einem Schmerzmodell, dem Zymosan-Überempfindlichkeit Pfotenmodell. Im Makrophagen-Modell konnte ST-1650 keine Phänotypverschiebung hinzu entzündungsauflösenden M2-Makrophagen bewirken, sowie in den Schmerzmodellen leider keine schnellere Schmerzauflösung als die Kontrollgruppe. Ob diese Effekte durch mangelnde oder zu geringer Entstehung von entzündungshemmenden Mediatoren zurückzuführen ist, ist noch unklar.
Für die SAR der 2-Aminothiazole als direkte 5-LO-Inhibitoren wurden über 60 Verbindungen synthetisiert und untersucht. Zu Beginn erfolgte eine Optimierung der Grundstruktur als 5-LO-Inhibitor. Es wurden die Einflüsse der Substituenten des Thiazolsrings und des Aminolinkers auf die 5-LO-Aktivität ermittelt, um die SAR initialer Arbeiten zu vertiefen. Nach der SAR-Untersuchung im intakten Zellsystem konnten durch Kombination bevorzugter Strukturelemente die zwei Verbindungen ST-1853 und ST-1906, als neue potente 5-LO-Inhibitoren entwickelt werden, die sich als nicht-toxisch herausstellten. Diese beiden 5-LO-Inhibitoren wirken um einen Faktor 10 potenter und sind weniger toxisch verglichen mit der Leitstruktur SKI-II. ST-1853 wurde innerhalb der Arachidonsäurekaskade auch auf Off-targets getestet, deren Aktivitäten sie erst bei 100-fach höherer Konzentration beeinflusst, sowie in humanem Vollblut, wo sie sich ihre 10-fach bessere Wirksamkeit im Vergleich zu SKI-II bestätigte. Darüber hinaus erwies sich ST-1853 bei den ersten Überprüfungen seiner Stabilität unter physiologischen Bedingungen wie bei der in vitro Metabolisierung durch Rattenlebermikrosomen als ausreichend stabil und daher zur weiteren Charakterisierung gut geeignet.
In der Abteilung „Medizinische Biotechnologie“ des Paul-Ehrlich-Instituts konnte gezeigt werden, dass ein SIVsmmPBj-abgeleiteter Vektor Vorteile gegenüber HIV-1-abgeleiteten Vektoren aufweist, da auch in der G0-Phase des Zellzyklus arretierte Zelllinien und Fibroblasten sowie primäre humane Monozyten transduziert werden können. Im ersten Teil der hier vorliegenden Arbeit wurden die besonderen Transduktionsfähigkeiten diese SIVsmmPBj Vektors eingehend untersucht. Zunächst wurden die transduzierbaren Monozyten morphologisch und biochemisch genauer charakterisiert; insbesondere wurde gezeigt, dass sich diese Zellen tatsächlich in der G0-Phase des Zellzyklus befinden und auch nach der Transduktion die Fähigkeit aufweisen, sowohl in Makrophagen als auch in Dendritischen Zellen auszudifferenzieren. Bei dem Versuch andere primäre humane Blutzellen zu transduzieren wurde gezeigt, dass SIVsmmPBj Vektoren für die Transduktion unstimulierter CD4+ T-Zellen nicht geeignet sind. Zum besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen die zur Transduktion arretierter Zellen und Monozyten durch SIVsmmPBj-abgeleitete Vektoren führen, wurde der Einfluss der akzessorischen viralen Proteine untersucht. Dazu wurde ein PBj-Knockout- Vektor, bei dem die Expression aller akzessorischen Gene (vif, vpx, vpr und nef) inhibiert war, generiert und zur Transduktion von arretierten Zellen und Monozyten eingesetzt. Keines der akzessorischen Proteine war für die Transduktion der in G0 arretierten Zellen notwendig. Für die Transduktion von Monozyten erwies sich das virale Protein Vpx jedoch als essentiell, da der Knockout-Vektor zur Transduktion von Monozyten nur nach Supplementierung mit diesem Protein in der Lage war. Die Supplementierung von HIV-1 Vektoren mit Vpx des SIVsmmPBj ermöglichte keine Transduktion von Monozyten, was darauf hindeutet, dass weitere Proteine von SIVsmmPBj oder aber auch die Fähigkeit der prinzipiellen Transduktion von Zellen der G0-Phase eine Rolle spielen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde ein auf SIVsmmPBj basierendes Dreiplasmid-Vektorsystem entwickelt. Für das Verpackungskonstrukt wurde das Verpackungssignal charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Bereich zwischen dem Promotor und dem Spleißdonor gelegene Bereich für eine effiziente Partikelbildung nötig ist und die Deletion der Region zwischen Spleißdonor und gag-Start-ATG zur Inaktivierung des Verpackungssignals ausreicht. Die aus dem Dreiplasmid-System generierten Vektoren erreichten Titer von bis zu 5 x 105 i.E./ml und waren nach Supplementierung mit Vpx dazu in der Lage, primäre humane Monozyten zu transduzieren. Der hier entwickelte, auf SIVsmmPBj basierende Vektor eröffnet neue Möglichkeiten in der Gentherapie. So sind nun auch Monozyten als wichtige Zielzellen der Tumortherapie einem Gentransfer durch lentivirale Vektoren zugänglich.
Analyse und Vorhersage von Kristallstrukturen tetraederförmiger Moleküle und fehlgeordneter Phasen
(2012)
Die Kristallstrukturen tetraederförmiger EX4-Moleküle mit E = C, Si, Ge, Sn, Pb und X = F, Cl, Br, I konnten in sieben Strukturtypen eingeteilt werden. In fast allen Verbindungen nehmen die Halogenatome eine verzerrte Kugelpackung (ccp, hcp, bcc, cp) ein. Die E-Atome besetzen in den dichtesten Kugelpackungen 1/8 aller Tetraederlücken, wobei sich für diese Atome ebenfalls eine Anordnung wie für verzerrte Kugelpackungen ergibt (cp, ccp, hcp). In den anderen Fällen (bcc, cp für die Anordnung der Halogenatome) ergibt sich für die Anordnung der E-Atome selbst ebenfalls eine verzerrte Kugelpackung (bcc, s). Dabei steht s für die Anordnung der E-Atome analog der Schwefelatome im Pyrit (FeS2). Jeder Strukturtyp unterscheidet sich in der Art der kürzesten Halogen-Halogen-Wechselwirkungen. Die in der Literatur für halogenierte organische Verbindungen beschriebenen Typen der Wechselwirkung lassen sich auch bei den EX4-Verbindungen finden. Die E-X-X-Winkel liegen in einem Bereich von 80-100° und 130-160° und sind damit etwas kleiner als für die halogenierten organischen Verbindungen. Mit Hilfe von Gitterenergieminimierungen konnten diverse potentielle Polymorphe für die EX4-Verbindungen vorhergesagt werden.
Eine vollständige Kristallstrukturvorhersage wurde für SiBr4 durchgeführt. Für diese Vorhersage wurden die Van-der-Waals-Parameter neu bestimmt. Dazu wurde das Br-Br-Potential mit Hilfe von Vergleichsrechnungen an den beiden experimentellen Strukturen des GeBr4 in den Raumgruppentypen Pa3, Z = 8 (s/ccp), und P21/c, Z = 4 (hcp/hcp), optimiert. Für die Vorhersage des SiBr4 konnten zwei der vorhergesagten Strukturen durch extern durchgeführte Kristallisationsexperimente bestätigt werden. Eine Hochtemperaturmodifikation kristallisiert oberhalb von 168K im Raumgruppentyp Pa3, Z = 8 im Strukturtyp s/ccp. Diese Struktur konnte bei der Vorhersage auf Rang 9 gefunden werden. Die Tieftemperaturmodifikation, die unterhalb von 168K vorliegt, kristallisiert im Raumgruppentyp P21/c, Z = 4 (Strukturtyp hcp/hcp). Diese Struktur hat Rang 4 der Vorhersage. Die vorhergesagten und experimentellen Strukturen zeigen nur geringe Abweichungen voneinander.
Für die tetraederförmigen E(CH3)4-Moleküle wurden für Tetramethylsilan und Tetramethylgerman vollständige Kristallstrukturvorhersagen durchgeführt. Die energetisch günstigste Struktur ist für beide Verbindungen im Raumgruppentyp Pa3 mit Z = 8 zu finden. Die energetisch zweitgünstigste Struktur hat den Raumgruppentyp Pnma mit Z = 4. Für Tetramethylsilan konnten die Strukturen mit Rang 1 und 2 experimentell bestätigt werden. Eine Hochdruckmodifikation des Tetramethylsilans kristallisiert im Raumgruppentyp Pa3 mit Z = 8. Diese Struktur entspricht der berechneten energetisch günstigsten Struktur auf Rang eins. Ihr konnte der Strukturtyp s/ccp zugeordnet werden. Mit Tieftemperatur-Röntgenpulverbeugungsexperimenten konnte eine Tieftemperaturmodifikation bei T = 100 K im Raumgruppentyp Pnma, Z = 4, mit Strukturtyp ccp/hcp gefunden werden.
Gitterenergieberechnungen wurden für die Strukturanalysen von drei fehlgeordneten Phasen eingesetzt. Experimentell bestimmte Kristallstrukturen von Azulen und Pigment Red 194 haben den Raumgruppentyp P21/c, Z = 2. Die Moleküle befinden sich dabei auf einer Punktlage mit Inversionssymmetrie. Da beide Moleküle kein Inversionszentrum aufweisen, kommt es zu einer Orientierungsfehlordnung. Für die rechnerische Analyse der Fehlordnung wurden jeweils sechs geordnete Modelle ausgehend von den fehlgeordneten Strukturen erstellt, die möglichst wenige Moleküle pro Elemenarzelle aufweisen sollten. Gitterenergieberechnungen und die Auswertung der Boltzmann-Verteilung zeigten, dass in bei beiden Kristallstrukturen eine statistische Fehlordnung der Moleküle vorliegt, die sich aus mehreren geordneten Modellen aufbauen lässt. Bei Azulen ist eine geordnete Struktur im Raumgruppentyp Pa, Z = 4, energetisch etwas günstiger als die anderen Modell. Für Pigment Red 194 zeigte sich, dass die Fehlordnung unter der Annahme, dass nur die berechneten Modelle die fehlgeordnete Struktur bilden, mit über 99%iger Wahrscheinlichkeit aus den vier energetisch günstigsten Modellen Pc, Z = 2, P21, Z = 2, P21/c, Z = 4 und Pc, Z = 4 besteht.
Die dritte untersuchte fehlgeordnete Struktur ist die des Natrium-p-chlorphenylsulfonat-Monohydrats. Die Fehlordnung bezieht sich hier nur auf die Phenylringe, die dort mit einer Besetzung von 50% zueinander senkrecht stehen. Mit Hilfe der Order-Disorder-Theorie konnten zwei geordnete Modelle im Raumgruppentyp P21/c und ein weiteres geordnetes Modell im Raumgruppentyp C1c1 (Z = 16, Z'= 2) aufgestellt werden. Gitterenergieminimierungen dieser Modelle zeigten, dass sich die Fehlordnung statistisch aus allen drei Modellen zusammensetzt. Das energetisch günstigste geordnete Modell im Raumgruppentyp P21/c, Z = 8 (Z' = 2), konnte als verzwillingte Struktur aus Einkristalldaten bestätigt werden.
CpG-Oligodesoxynukleotide (CpG-ODN) sind von medizinischem Interesse aufgrund ihrer immunstimulierenden Wirkung, die durch chemische Wechselwirkungen zwischen dem Toll-like-Rezeptor 9 und dem CpG-Oligodesoxynukleotid ausgelöst wird. Um die molekulare Grundlage dieser DNA-Protein-Erkennung näher zu erforschen und um neue modifizierte CpG-Oligodesoxynukleotide mit einem verbessertem Wirkungsprofil für medizinische Anwendungen zu synthetisieren, wurde diese Arbeit angefertigt. Untersucht wurde, welche Synthesestrategie eine effiziente Syntheseroute zur Modifizierung von CpG-Oligodesoxynukleotiden ermöglicht. Als prinzipiell interessante Modifikationen wurden solche gewählt, die dem CpG-ODN-Liganden, Toll-like-Rezeptor 9, zusätzliche Wechselwirkungen eröffnen, wie die H-Brückenwechselwirkungen durch OH, NH2, NO2 oder pi-Stacking-Wechselwirkungen, wie durch z. B. Phenyl oder Pyren. Zunächst wurde in Erwägung gezogen, die bislang in der Literatur nicht für CpG-ODN unter-suchte Position 6 von Cytidin mit OH oder NH2 modifizieren. Hierfür wurde die allgemeine Synthesestrategie verwendet, bei der die Cytosin-Derivate stereoselektiv durch Vorbrüggen-Glykosilierung mit peracetylierter Ribose zum Nukleosid umgesetzt werden. Anschließend erfolgte die Deacetylierung, die regiospezifische Einführung der Tetra-(iso-propyl)-di-siloxan-Schutzgruppe an der 3´,5´-Position. Danach sollte die 2´-OH-Funktion mit Thio-phenylchlorid verestert und nach Barton McCombie desoxygeniert werden. Nach Dimethoxy-triphenylmethylierung an der 5´-OH-Funktion sollte die Umsetzung zum Phosphoramidit erfolgen. ...
Identifizierung und Charakterisierung neuer Inhibitoren der C2-ähnlichen Domäne der 5-Lipoxygenase
(2011)
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) katalysiert die ersten beiden Schritte der Leukotrien (LT)-Biosynthese (Samuelsson et al., 1987). Das Substrat Arachidonsäure (AA) wird im ersten Schritt zu einem Fettsäurehydroperoxid, der 5(S)-Hydroperoxy-6-trans-8,11,14-cis-Eikosatetraensäure (5-HpETE) oxidiert. Durch Dehydrierung entsteht im zweiten Reaktionsschritt das instabile Epoxid LTA4. Weiter wandeln zwei Synthasen das LTA4 zum einen in LTB4 oder zum anderen in die Cysteinyl-LTs C4, D4 und E4 um (Samuelsson et al., 1987). Die 5-LO wird in Zellen myeloiden Ursprungs exprimiert und kommt vor allem in reifen Leukozyten vor.
LTs spielen eine wichtige Rolle bei der angeborenen Immunantwort und vermitteln vor allem entzündliche und allergische Reaktionen (Funk 2001; Peters-Golden & Henderson, 2007). Asthma bronchiale, kardiovaskuläre Erkrankungen wie Atherosklerose, Osteoporose oder verschiedene Krebsarten werden im Zusammenhang mit der 5-LO untersucht (Werz & Steinhilber, 2006). Die Inhibition der LT-Biosynthese oder die Senkung der LT-Spiegel stellt eine Möglichkeit dar, den entzündungsfördernden Eigenschaften entgegenzuwirken. Inhibitoren der LT-Biosynthese lassen sich in indirekte und direkte 5-LO-Inhibitoren gliedern. Zu den indirekten 5-LO-Inhibitoren zählen FLAP-Antagonisten (Young, 1991; Evans et al., 2008) sowie CysLT1-Rezeptorantagonisten (Darzen, 1998). Von den vier Gruppen der direkten 5-LO-Inhibitoren (redoxaktive, Eisenligand-, nichtredox- sowie diverse Inhibitoren (Pergola & Werz, 2010)) ist bisher nur Zileuton (Carter et al., 1991), ein Eisenligand-Inhibitor, als Wirkstoff zur Behandlung von Asthma bronchiale in den USA zugelassen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die neuartige Klasse der Imidazo[1,2-a]pyridine hinsichtlich ihrer 5-LO-Inhibition, ihrer Löslichkeit sowie ihrer Effekte auf die Zellviabilität zu evaluieren und zu optimieren. Dabei stand das Verständnis der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung im Fokus. Ausgehend von Substanz A14, der potentesten Substanz eines virtuellen Screenings nach dualen COX/5-LO-Inhibitoren (Hofmann et al., 2008), wurden 78 Substanzen in ionophor-stimulierten intakten polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) sowie im zellfreien System, dem Überstand nach 100.000 × g Zentrifugation (S100) von homogenisierten PMNL, bezüglich ihrer inhibitorischen Aktivität untersucht. Die Effekte auf die Zellviabilität nach Inkubation mit den Substanzen für 48 h auf die humane leukämische Monozytenvorläufer Zelllinie U937 wurden mit Hilfe eines WST-Assays, der die mitochondriale Aktivität misst, sowie eines LDH-Assays, zur Bestimmung der Freisetzung von LDH als Folge von Nekrose, evaluiert.
Innerhalb der Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) der 78 Derivate konnte kein eindeutiges Substitutionsmuster, das sowohl in intakten PMNL als auch in zellfreiem S100 zu den gleichen Schlüssen führt, festgestellt werden. Ausgehend von Substanz A14 konnte die inhibitorische Aktivität verbessert werden, wobei Substanzen mit nanomolaren IC50-Werten in beiden Assaysystemen resultierten. Die Substanzen lassen sich in drei strukturelle Teile gliedern: Einen oberen Teil am sekundären Amin, ein bizyklisches N-fusioniertes Imidazopyridin (Teil A) sowie einen Teil B am aromatischen Kern. Nur für den oberen Teil ließ sich ein allgemein-gültiges Substitutionsmuster feststellen. Am sekundären Amin führen in intakten PMNL größere Substituenten zu einer Verbesserung der inhibitorischen Aktivität, wobei dies bis zu einer Cyclohexylgruppe gilt und eine Adamantyl-Substitution eine Ausnahme bildet. Allgemein lässt sich feststellen, dass bei einer Cyclohexylgruppe am sekundären Amin und einer Methylgruppe an Position 6 in Teil A, die Substituenten in Teil B stark variieren können, ohne an inhibitorischer Aktivität zu verlieren. Werden innerhalb des oberen Teils oder in Teil A die Substituenten polarer, sind in Teil B weniger Variationen möglich. Es werden insbesondere lipophile Reste toleriert. Beim Versuch, die Löslichkeit zu verbessern, zeigte sich, dass ein Gleichgewicht zwischen polaren und unpolaren Substituenten vorliegen muss. Auch die Einflüsse der Substituenten auf die Zellviabilität konnten nicht einem allgemein-gültigen Muster unterworfen werden. Mit Substanz 15 konnte ein Derivat identifiziert werden, das verglichen mit der Ausgangssubstanz A14 eine verbesserte inhibitorische Aktivität aufweist (IC50-Werte von 0,16 µM (PMNL) und 0,1 µM (S100)), löslicher ist (clogP-Wert von 4,6) und keine Nekrose auslöst. Weiter zeigten auch die Substanzen 31 und 50 eine Verbesserung der inhibitorischen Aktivität (IC50-Werte von 0,26 µM bzw. 0,58 µM (PMNL) und 0,8 µM bzw. 0,16 µM (S100)) ohne Nekrose auszulösen, wobei Substanz 50 zusätzlich eine verringerte Lipophilie (clogP-Wert von 4,2) aufweist. Substanz 76 ist mit einem IC50-Wert von 6 nM die im zellfreien System aktivste Substanz unter den 78 getesteten Derivaten.
Ein vielversprechender Vertreter dieser neuartigen Klasse der Imidazo[1,2-a]pyridine, Substanz 15 (EP6), wurde in verschiedenen Assaysystemen charakterisiert. EP6 ist ein hochwirksamer Inhibitor der 5-LO mit einem IC50-Wert von 0,16 µM in intakten PMNL und weist im zellfreien S100 von PMNL einen IC50-Wert von 0,1 µM, am partiell gereinigten Enzym einen IC50-Wert von 0,05 µM auf. Die vergleichbare inhibitorische Aktivität in intakten Zellen sowie im zellfreien System lässt auf eine direkte Inhibition der 5-LO schließen. Die Zugabe der allosterischen Faktoren ATP oder Calcium hat keinen Einfluss auf die Potenz von EP6. Auch ist die Inhibition nicht vom Redoxzustand der Zelle abhängig, wie im Falle bekannter nichtredox-Inhibitoren (Werz et al., 1998). Die Zugabe von steigenden Mengen an exogenem Substrat AA zu S100 von PMNL führt zu keiner Beeinträchtigung der Potenz von EP6, was im Vergleich zu den nichtredox-Inhibitoren einen Vorteil bei entzündlichen Prozessen mit erhöhten Lipidhydroperoxid-Spiegeln darstellt. Bei ionophor-stimulierten PMNL ohne die Zugabe von exogenem Substrat resultiert ein sechsfach höherer IC50-Wert von 1,2 µM, der auf eine allosterische Inhibition durch EP6 hinweist, bei der Substrat in ausreichenden Mengen vorliegen muss, damit EP6 mit dem 5-LO-AA-Komplex interagieren kann. Darüber hinaus inhibiert EP6 die LT-Bildung unabhängig von der Art der 5-LO-Stimulation bei einer Zugabe von 20 µM exogener AA. Der physiologische Stimulus in PMNL über N-Formylmethionyl-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) führt zu einem höheren IC50-Wert von 0,76 µM mit Zugabe von 20 µM AA und bestätigt die Ergebnisse von ionophor-stimulierten PMNL ohne Zugabe von exogenem Substrat. Für EP6 konnte weiterhin eine allosterische Bindestelle an der C2-ähnlichen Domäne der 5-LO postuliert werden. Die Zugabe von Phosphatidylcholin führte zu einer verminderten inhibitorischen Aktivität. Durch Experimente mit einer Mutante der 5-LO, bei der die Tryptophane, welche die Membranbindung vermitteln, ausgetauscht sind (3W-Mutante), konnte die Interaktion dieser Aminosäuren mit EP6 gezeigt werden. Über einen Kompetitionsassay mit der C2-ähnlichen Domäne, Mutations- und Docking-Studien, wurden die Aminosäuren Y81, Y100 und Y383 des Interfaces der beiden Domänen der 5-LO als essentiell für die Bindung identifiziert. Somit zählt EP6 als Vertreter der Klasse der Imidazo[1,2-a]pyridine neben Hyperforin und AKBA zu den einzigen mit der C2-ähnlichen Domäne interagierenden 5-LO-Inhibitoren.
EP6 ist ein selektiver Inhibitor der 5-LO, der die 15-LO1, 15-LO2 und 12-LO nicht inhibiert. Weiterhin werden drei weitere Enzyme der AA-Kaskade, die Cyclooxygenase-1 und -2 sowie die mikrosomale Prostaglandin E2 Synthase-1 nicht durch EP6 beeinflusst. Neben der humanen 5-LO wird auch die murine 5-LO, in intakten RAW 264.7 Zellen und deren S100 getestet, mit niedrig mikromolarem bzw. nanomolarem IC50-Wert inhibiert, was die erste Voraussetzung für potentielle in vivo Studien darstellt.
Die Inhibition der 5-LO-Produktbildung in humanem Vollblut konnte jedoch bis zu einer Konzentration von 30 µM EP6 nicht gehemmt werden. EP6 ist lipophil (clogP-Wert von 4,6) und weist eine hohe Plasmaproteinbindung (Bindung an humanes Serumalbumin von 97,5 ± 0,7% bei 10 µg/ml EP6) auf, was die Unwirksamkeit in humanem Vollblut erklären könnte.
Abschließend wurden die Effekte von EP6 auf die Zellviabilität untersucht. Die Experimente wurden zunächst in U937 bei einer Inkubationszeit von 48 h mit einer maximalen Konzentration von 30 µM EP6 durchgeführt. EP6 führt zu keinen unmittelbaren zytotoxischen Effekten innerhalb der Inkubationszeit der in dieser Arbeit durchgeführten Aktivitätsassays (gezeigt in PMNL). Weiter wurde jedoch gezeigt, dass die mitochondriale Aktivität nach Inkubation für 48 h mit einem EC50-Wert von 14 µM beeinträchtigt wird (WST-Assay). Dieser Effekt ist jedoch nicht auf Nekrose zurückzuführen, da die gemessene Konzentration an freigesetztem LDH gering bleibt. Über ein Langzeitexperiment wurde die Abnahme der Lebendzellzahl nach Inkubation mit 30 µM EP6 nach 24 h festgestellt. Über Detektion von PARP-Spaltung, einem Marker für späte Apoptose, stellte sich heraus, dass EP6 in U937 Apoptose induziert. Zusätzlich zu den Untersuchungen der leukämischen Zelllinie wurden humane nicht-tumor Zellen (RPE) im Langzeitexperiment sowie im BrdU-Assay untersucht. EP6 beeinträchtigt die Lebendzellzahl der nicht-tumor Zelllinie RPE nicht und führt nur zu geringen antiproliferativen Effekten.
Nichtmethan-Kohlenwasserstoffe sind in Gegenwart von Stickstoffoxiden (NO, NO2) wichtige Vorläufersubstanzen von troposphärischen Photooxidantien (z. B. Ozon), die beim photochemischen Metabolismus gasförmiger organischer Verbindungen durch Hydroxylradikale (OH) unter Einwirkung von Sonnenlicht gebildet werden. Experimenteller Beitrag dieser Arbeit ist die Charakterisierung, Modifizierung, Optimierung und Qualitätssicherung des zur Messung von leichtflüchtigen atmosphärischen C2-C10 Kohlenwasserstoffen verwendeten mobilen Gaschromatographen (GC) mit Flammenionisationsdetektor (AirmoVOC HC2010). Im Rahmen des vom BIvIBF geförderten Berlin Ozonexperiments BERLIOZ, das im Sommer 1998 im Großraum Berlin/Brandenburg stattfand, wurden an einer ländlichen Bodenstation in Blossin, 40 km südöstlich Berlins, in situ Messungen von 69 Nichtmethan-Kohlenwasserstoffen durchgeführt. im Vorfeld der Feldkampagne wurde der GC einer umfangreichen Qualitätssicherung unterzogen. Bei einer Immissionsvergleichsmessung, die unter Beteiligung aller Arbeitsgruppen stattfand, ergab sich eine mittlere konzentrationsabhängige Abweichung des HC-2010 von ± 16% und ein konstanter Offset (Bias) von 0,71 nmol/m3 (16 pptv) vom Referenzmeßverfahren des Forschungszentrums Jülich. Die Geräteblindwerte waren für die meisten Analyten kleiner 0,3 nmol/m3 (6 pptv). Aus der dreifachen Standardabweichung der Blindwerte ergaben sich die für Außenluftuntersuchungen geforderten Nachweisgrenzen um 0,4 nmol/m3 (10 pptv). Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der BERLIOZ-Datensatz hinsichtlich einer Bestandsaufnahme ausgewertet. Die beobachteten Konzentrationen der einzelnen Kohlenwasserstoffe wiesen jeweils eine logarithmische Normalverteilung auf, die Charakterisierung des Datensatzes erfolgte deshalb nicht anhand von arithmetischem Mittelwert und Standardabweichung, sondern mit geometrischem Mittelwert und multiplikativer Standardabweichung. Anhand der OH-Verlustrate wurde der Einfluß der verschiedenen Kohlenwasserstoffe auf die lokale Bildung von Photooxidantien untersucht. Der natürliche Kohlenwasserstoff Isopren lieferte mit 70% den weitaus größten mittleren Beitrag zur Photooxidantienproduktion am Boden. In der Grenzschicht verlor isopren allerdings seine dominante Rolle. Sein Beitrag schrumpfte mit zunehmender Höhe auf 20-40%. in der in 200 m Höhe beobachteten Abluftfahne Berlins verursachten anthropogene Kohlenwasserstoffe rund 2/3 der OH-Verlustrate, wobei die reaktiven C3/C4-Alkene alleine bereits 50% beitrugen.
In dieser Arbeit wurden die Strukturen von drei Membranproteinen mittels Einzelpartikel-Kryo‑Elektronenmikroskopie (Kryo‑EM) gelöst. Bei den Membranproteinen handelt es sich um den humanen TRP-Kanal Polycystin‑2, den sekundär-aktiven Transporter BetP aus Corynebacterium glutamicum und den Rotor-Ring der N‑Typ ATPase aus Burkholderia pseudomallei.
Kanäle sind Membranproteine, die Ionen durch eine Pore über die Membran diffundieren lassen. Durch einen präzisen, kanalabhängigen Regulationsmechanismus wird die Pore nur bei Bedarf geöffnet. TRP (transient receptor potential) Kanäle sind anhand von DNA-Sequenzvergleichen identifiziert worden und kommen ausschließlich in Eukaryonten vor. In dieser Arbeit lag der Fokus auf der Strukturbestimmung des humanen TRP Kanals Polycystin‑2 (PC‑2). PC‑2 wurde in einer Studie entdeckt, in der Patienten mit der autosomal dominanten Erbkrankheit „polyzystische Nierenerkrankung“ untersucht wurden. Patienten mit dieser Krankheit tragen eine Mutation in einem der beiden Gene PKD1 oder PKD2, welche für die Proteine Polycystin‑1 und ‑2 kodieren. In dieser Arbeit wurden verschiedene Deletionsmutanten von PC‑2 hergestellt und in das Genom menschlicher HEK293 GnTI‑ Zellen inseriert. Die Zellen, die PC‑2 bzw. die Deletionskonstrukte am stärksten synthetisierten, wurden isoliert und für die rekombinante Proteinherstellung verwendet. Die Expression von PC‑2 führte zu der Entstehung von kristalloidem endoplasmatischem Retikulum. Mutationsstudien in dieser Arbeit zeigen, dass diese morphologische Veränderung durch die Akkumulation von Membranproteinen, die mit sich selbst interagieren, begünstigt wird. Weiter ist es in dieser Arbeit gelungen, PC‑2 zu reinigen und die Struktur des Proteins mit Hilfe von Einzelpartikel Kryo-EM mit einer Auflösung von 4.6 Å zu bestimmen. Die Membrandomäne von PC‑2 ist sehr ähnlich zu den bekannten TRP Kanal Strukturen. Ein Vergleich der PC‑2 Struktur mit dem offenen und geschlossenen TRPV1 Kanal legt nahe, dass PC‑2 in seiner offenen Konformation gelöst wurde.
Der sekundär aktive Transporter BetP von C. glutamicum gehört zu der Familie der BCC- (betaine-carnitine-choline) Transporter und wird durch osmotischen Schock aktiviert. Nach seiner Aktivierung importiert BetP zwei Natriumionen und ein Glycinbetain Molekül. Durch die Akkumulierung von Glycinbetain in der Zelle steigt das osmotische Potential des Zytoplasmas, was den Wasserausstrom aus der Zelle stoppt. Viele Strukturen, die BetP in unterschiedlichen Stadien des Transportprozesses zeigen, konnten bereits mittels Röntgenkristallographie gelöst werden. Allerdings ist die N‑terminale Domäne für die Kristallisation entfernt worden und die C‑terminale Domäne, die komplett aufgelöst ist, ist an einem wichtigen Kristallkontakt beteiligt. Um strukturelle Informationen über die N‑ und C‑terminale Domäne ohne Kristallisationsartefakte zu erhalten, wurde in dieser Arbeit die Struktur von BetP mittels Einzelpartikel Kryo‑EM bestimmt. Die Struktur mit einer Auflösung von 6.8 Å zeigt BetP in einem zum Zytoplasma geöffneten Zustand. Der größte Unterschied zu allen Kristallstrukturen ist die Position der C‑terminalen α‑Helix, die um ~30° rotiert ist und dadurch deutlich enger am Protein zu liegen kommt. Da BetP in Abwesenheit von aktivierenden Stoffen analysiert wurde, wird vermutet, dass es sich bei der gelösten Struktur um den inaktiven Zustand von BetP handelt.
Rotierende ATPasen sind membrangebunden Enzymkomplexe, die bei der zellulären Energieumwandlung eine entscheidende Rolle einnehmen. Sie bestehen aus einem löslichen und einem membrangebundenen Teil. Während in dem löslichen Teil der zelluläre Energieträger Adenosintriphosphat (ATP) entweder synthetisiert oder hydrolysiert wird, baut der membrangebundene Teil entweder einen Ionengradienten auf oder nutzt die Energie eines existierenden Gradienten für die ATP Synthese. Ein wesentlicher Bestandteil des membrangebundenen Teils einer rotierenden ATPase ist der Rotor-Ring. Dieser transportiert Ionen über die Membran und rotiert dabei um seine eigene Achse. In dieser Arbeit wurde eine Studie fortgesetzt, die den Rotor-Ring der N‑Typ ATPase von B. pseudomallei mittels Kryo‑EM untersuchte und zeigte, dass der Rotor-Ring aus 17 identischen Untereinheiten aufgebaut ist. Damit hat die N‑Typ ATPase das größte Ionen-zu-ATP-Verhältnis aller bisher charakterisierten ATPasen. In dieser Arbeit wurde die c17 Stöchiometrie des N‑Typ ATPase Rotor-Rings bestätigt und die Struktur mittels Kryo‑EM bestimmt. Im besonderen Fokus lag dabei der Einfluss von Detergenzien auf die Strukturbestimmung. Es konnte gezeigt werden, dass die beiden Parameter Dichte und Mizellengröße der verwendeten Detergenzien ausschlaggebend für den Erfolg der Strukturbestimmung dieses sehr kleinen Membranproteins sind.
Plants absorb sunlight via photosynthetic pigments and convert light energy intochemical energy in the process of photosynthesis. These pigments are mainly bound to antenna protein complexes that funnel the excitation energy to the photosynthetic reaction centres. The peripheral antenna of plant photosystem II (PSII) consists of the major light-harvesting complex of PSII (LHC-II) and the minor LHCs CP29, CP26 and CP24. Light intensity can change frequently and plants need to adapt to high-light conditions in order to avoid photodamage. When more photons are absorbed than can be utilised by the photosynthetic machinery, excessive excitation energy is dissipated as heat by short-term adaptation processes collectively known as non-photochemical quenching (NPQ). A decrease in PSII antenna chlorophyll (Chl) fluorescence yield and a reduction in the average Chl fluorescence lifetime are associated with NPQ. The main component of NPQ is the so-called energy-dependent quenching (qE), and it is triggered by the rapid drop in thylakoid lumenal pH resulting from the plant’s photosynthetic activity. This process is thought to take place at the PSII antenna complexes, which therefore not only capture and transfer light energy but are also involved in balancing the energy flow. The decrease in lumenal pH acivates the enzyme violaxanthin de-epoxidase (VDE), which converts the xanthophyll violaxanthin (Vio) into zeaxanthin (Zea) in the xanthophyll cycle. In addition, the PSII subunit PsbS was discovered to be essential for qE by screening qE-deficient Arabidopsis thaliana mutants. This membrane protein is considered a member of the LHC superfamily, which also includes LHC-II and the minor LHCs. Previous studies on PsbS isolated either from native source or refolded in vitro have produced inconsistent results on its pigment binding capacity. Interestingly, a pH-dependent change in the quaternary structure of PsbS under high light conditions has been reported. This observed dimer-tomonomer transition very likely follows the protonation of lumenal glutamates upon the drop in pH and is accompanied by a change in PSII supercomplex localisation. PsbS dimers are preferentially found in association with the PSII core, whereas PsbS monomers co-localise with LHC-II.Despite the identification of !pH, Zea and PsbS as key players in qE, both the nature of the quencher(s) as well as the underlying molecular mechanism leading to excess energy dissipation still remain unknown. Several models have been put forward to explain the reversible switch in the antenna from an energy-transmitting to a quenched state. Proposals include a simple pigment exchange of Vio for Zea, and aggregation or an internal conformational change of LHC-II. Charge transfer (CT)quenching in the minor LHCs or quenching by carotenoid dark state (Car S1)-Chl interactions have also been suggested. However, none of these qE models has so far been capable of accommodating all the physiological observations and available experimental data. Most importantly, the function of PsbS remains an enigma. A recent qE model suggested that monomerisation of PsbS enables the protein to transiently bind a carotenoid and form a quenching unit with a Chl of a PSII LHC. In view of the various proposed qE mechanisms, this thesis aimed at understanding the interplay of the different qE components and the contribution of the PSII subunits LHC-II, the minor LHCs and PsbS to qE. The initial approach was to investigate the properties of the PSII subunits in the most simple in vitro model system, namely in detergent solution. For this purpose, LHC-II was isolated either from native source or refolded from recombinantly produced protein. Investigation of the minor LHCs and PsbS required heterologous expression and refolding. In addition, experiments were performed on aggregated LHC-II. Aggregates of LHC-II have been used as a popular model system for qE because they exhibit highly quenched Chl fluorescence. At the final stage of this doctoral work, a more sophisticated model system to approximate the thylakoid membrane was developed by reconstitution of the PSII subunits LHC-II and PsbS into liposomes. This system not only allowed for investigation of these membrane proteins in their native environment, but also for mimicking the xanthophyll cycle by distribution of Zea within the membrane as well as !pH by outside buffer exchange. The role of Zea in qE was first investigated with detergent solubilised antenna proteins. The requirement of this xanthophyll for qE is well-known, but the specific contribution to the molecular quenching mechansim is unclear. Previous work had shown that replacement of Vio for Zea in LHC-II was not sufficient to induce Chl fluorescence quenching in Zea-LHC-II, as suggested by the so-called molecular gearshift mechanism. However, by means of selective two-photon excitation spectroscopy, an increase in electronic interactions between Car S1 and Chls was observed for LHC-II upon lowering the pH of the detergent buffer. Electronic Car S1-Chl coupling became even stronger when Zea-LHC-II was probed. The extent of Car S1-Chl coupling correlated directly with the extent of Chl fluorescence quenching, in a similar way as observed previously in live plants under high-light conditions. However, very similar results were obtained with LHC-II aggregates. This implied that the increase in electronic interactions and fluorescence quenching was independent of Zea and low pH. Further experiments on aggregates of LHC-II Chl mutants indicated that the targeted pigments were also not essential for the observed effects. It is proposed that the same molecular mechanism causes an increase in electronic Car S1-Chl interactions and Chl fluorescence quenching in Zea-LHC-II at low pH as well as in aggregated LHC-II. Most likely, surface exposed pigments form random quenching centres in both cases. On the other hand, it was possible that Zea could act as a direct quencher of excess excitation energy in the minor LHCs. However, enrichment of refolded CP29, CP26 and CP24 with Zea did not lead to a change in the Chl excited state lifetime. Formation of a carotenoid radical cation, previously implied in CT quenching, was also not observed, although artificial generation of such a radical cation was principally possible as shown for CP29. During the course of this work, a study reporting the formation of Zea radical cations in minor LHCs was published. Therefore, Zea-enriched minor LHCs were again investigated on the experimental apparatus used in the reported study. Indeed, the presence of at least one carotenoid radical cation for each minor complex was detected. It is suggested that either the preparation method of incubating the refolded minor LHCs with Zea in contrast to refolding the complexes with only Zea and lutein causes the observed differences or that the observed spectral radical cation signatures are due to experimental artifacts. While the experiments with LHC-II and the minor LHCs gave useful insights into the putative qE mechanism, the quencher site and the mode of action of Zea could still not be unambiguously identified. Most importantly, these studies could not explain the function of the qE keyplayer PsbS. Therefore, the focus of the work was shifted to PsbS protein production, purification and characterisation. In view of inconsistent reports on the pigment binding capacity of this PSII subunit, refolding trials with and without photosynthetic pigments were conducted. The formation of a specific pigmentprotein complex typical for other LHCs was not observed and neither was the earlier reported “activation” of Zea for qE by binding to this protein. Nevertheless, PsbS refolded without pigments displayed secondary structure content in agreement with previous studies, indicating pigment-independent folding. Reconstitution of pigmentfree, refolded PsbS into liposomes confirmed that the protein is stable in the absence of pigments. Zea distributed in PsbS-containing liposomes also showed no spectral alteration that would indicate its “activation”. With the ability to reconstitute PsbS, it was then possible to proceed to modelling qE in a proteoliposome system. For this purpose, PsbS was co-reconstituted with LHC-II, which has been reported to interact with PsbS. One-photon excitation (OPE) and two-photon excitation (TPE) spectroscopy measurements were performed on LHC-II- and LHC-II/PsbS-containing liposomes. This enabled both quantification of Chl fluorescence quenching as well as determination of the extent of electronic Car S1-Chl interactions. The effect of Zea was investigated by incorporating it in the proteoliposome membrane. It was shown that Zea alone was not able to induce significant Chl fluorescence quenching when only LHC-II was present. However, when LHC-II and PsbS were co-reconstituted, pronounced Chl fluorescence quenching and an increase in electronic Car S1-Chl interactions were observed and both effects were enhanced when Zea was present. Western blot analysis indicated the presence of a LHC-II/PsbS-heterodimer in these proteoliposomes. In addition to the OPE and TPE measurements, the average Chl fluorescence lifetime was determined in detergent-free buffer at neutral pH and directly after buffer exchange to low pH. No significant changes in the average lifetime were observed for LHC-II proteoliposomes when either Zea was present or after exchange for low pH buffer. This indicated that Zea alone cannot act as a direct quencher, which concurs with the OPE measurements. Moreover, the complex was also properly reconstituted as no aggregation or significant Chl fluorescence quenching were observed. The average lifetime was not significantly affected in LHC-II/PsbS-proteoliposomes, independent of Zea or pH. However, a shortlived component in the presence of a long-lived component was not resolvable with the time resolution of the fluorescence lifetime apparatus.
Implications for qE model systems and the in vivo quenching mechanism are discussed based on the experiments in detergent solution, on LHC-II aggregates and with the proteoliposome model system.
Die endotheliale NO-Synthase (eNOS) ist im kardiovaskulären System der Hauptproduzent von Stickstoffmonoxid (NO). Studien deuten auf eine Beteiligung der eNOS im Krankheits-verlauf einer Leberzirrhose hin; zirrhotische Tiere zeigen eine reduzierte hepatische eNOS-Aktivität bei unveränderten Proteinmengen. Die reduzierte NO-Menge trägt zu einer Erhöh-ung des intrahepatischen Widerstandes und einer portalen Hypertonie bei. Inhibitoren und posttranslationale Modifikationen der eNOS wurden als auslösende Faktoren postuliert, aber auch am intrazellulären Transport der eNOS beteiligte Proteine könnten eine wichtige Rolle spielen. Ein solches ist das neue Protein NOSTRIN (“eNOS traffic inducer”), das über seine C-terminale SH3-Domäne an eNOS bindet und durch seine N-terminale FCH Domäne an Membranen assoziiert. In vorhergegangenen Studien wurde nur ein translatiertes Protein identifiziert, bezeichnet als NOSTRINalpha. In der vorliegenden Arbeit habe ich eine verkürzte Isoform entdeckt (NOSTRINbeta), die aus einem alternativen Spleißvorgang hervorgeht. Ihr fehlt fast die gesamte FCH Domäne, wodurch keine Membranbindung mehr stattfindet. Diese Isoform konnte nur in pathogenem Lebergewebe nachgewiesen werden. Untersuchun-gen mittels Western Blotting und qRT-PCR mit Proben aus Patienten mit Zirrhose, alkoholischer Hepatitis oder von gesunden Personen, zeigten eine deutliche Erhöhung der Expression beider NOSTRIN-Isoformen von gesundem zu zirrhotischem Gewebe. NOSTRINalpha mRNA-Mengen waren in zirrhotischen vs. gesunden Proben verdoppelt, und in Proben aus Patienten mit zusätzlicher Hepatitis verdreifacht. Dies deutet darauf hin, dass erhöhte Mengen von NOSTRINalpha zu einer Internalisierung und Inaktivierung der eNOS führen könnten. NOSTRINalpha und NOSTRINbeta wurden ebenfalls in Hep3B-Zellen auf Protein und mRNA-Ebene nachgewiesen, ihre Expression war durch Retinsäure zeit- und dosisabhängig stimulierbar. NOSTRINalpha lokalisiert an Plasmamembran und vesikulären Strukturen, NOSTRINbeta hingegen hauptsächlich im Zellkern, eine geringe Fraktion im Zytosol. Über Kartier-ungsstudien wurden zwei nuclear leading sequences (NLS) identifiziert, die den Transport in den Zellkern vermitteln, sowie eine Crm-1-abhängige nuclear export sequence (NES). Im EMSA konnte die Bindung von NOSTRINbeta an die Promotorregion des NOSTRIN-Gens gezeigt werden. Diese Ergebnisse legen eine Funktion von NOSTRINbeta als Transkriptionsfaktor nahe, evtl. innerhalb einer negativen Rückkopplung auf die NOSTRINalpha-Expression. Weiter-führende Studien sollen diesen potentiellen molekularen Mechanismus im Detail klären.
Das genetische Material der Zellen besteht aus Molekülketten der Desoxyribonukleinsäure (DNA), die ein Träger der Erbinformation ist. In normalen Körperzellen wird die Erbinformation der DNA in eine andere Molekülkette, die sogenannte Ribonukleinsäure (RNA), übersetzt. Die RNA reguliert die Bildung von neuem Protein in der Zelle. Dass die RNA nicht bloß ein „Stempel“ ist, der die Informationen der DNA weitervermittelt, darin sind sich die Experten heute einig. RNA-Moleküle können Informationen speichern, katalytische Aktivitäten entfalten, sich perfekt tarnen, und sie regulieren auch als Produkt ihre eigene Synthese. Manche Viren enthalten ebenfalls RNA (oder DNA) und können so den Produktionsapparat der Zelle täuschen. Erkenntnisse über die Wechselwirkung dieser RNA mit natürlichen und synthetischen Liganden können zur Suche nach potentiellen Wirkstoffen beitragen. Nukleinsäuren sind lineare Biopolymere von grundlegenden Untereinheiten, die Nukleotide genannt werden und aus Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G), Urazil (U), und Thymin (T) zusammengesetzt sind. Sie sind jedoch in der Lage sich zu falten und so eine Doppel-Helixstruktur auszubilden. Diese besteht größtenteils aus den bekannten "Watson-Crick-Basenpaaren" (G-C und A-U oder A-T), die zur Stabilität der Struktur beitragen, sowie aus den weniger stabilen G-U-Paaren. Durch die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Sekundärstrukturelementen entstehen Tertiärstrukturelemente, deren Struktur und Dynamik oft nur schwer experimentell zu bestimmen sind. Fortschritte in der RNA-Strukturanalyse wurden durch Röntgenkristallographie und Kernresonanzspektroskopie (NMR) möglich. Durch die Röntgenkristallographie wurden viele RNA-Eigenschaften festgestellt. Allerdings besteht keine Kristallstruktur für alle mögliche Einzelnfaser-RNA-Haarnadeln, weil diese immer dazu neigen, in eine linearen doppelte Faserform zu kristallisieren, die geringe biologische Bedeutung hat. Außerdem wurde mit Hilfe der NMR-Spektroskopie das dynamische Verhalten von RNA, z.B. Entfaltungsprozesse bei ansteigender Temperatur, beobachtet. Jedoch erlauben diese experimentellen Daten oft keine direkte mikroskopische Beschreibung der molekularen Prozesse. Molekulardynamik (MD)-Simulationen von biologischen Systemen ermöglichen es hingegen, diese Prozesse in atomischem Detail zu untersuchen. Die MD-Simulation beschreibt ein molekulares System auf atomarer Ebene mit Hilfe der klassischen Mechanik. Kräfte werden von empirischen Potentialen abgeleitet. Sie liefern zeitabhängige Trajektorien, die sich aus den Newton'schen Bewegungsgleichungen ergeben. Durch verbesserte Computerleistung, bessere Kraftfelder, und neu entwickelte genauere Methoden stimmen heutzutage MD-Simulationen von RNA mit experimentellen Daten immer besser überein. In meiner Doktorarbeit wurden MD-Simulationen durchgeführt um die Dynamik, die Struktur und insbesondere die Stabilität von RNA-Hairpins theoretisch zu beschreiben, um so ein erweitertes Verständnis für die dynamischen Vorgänge zu erhalten. Auch der SFB 579 der Universität Frankfurt beschäftigt sich mit RNA-Systemen. Erforscht wird unter anderem der D-Loop des Coxsackievirus B3 (CVB3), der Virenmyocarditis verursacht. Die Interpretation dieser experimentellen Daten wird durch MD-Simulation möglich. In dieser Arbeit wurden das GROMACS Software-Paket und das AMBER Kraftfeld verwendet, um das strukturelle, dynamische und thermische Verhalten der RNA-Hairpins mit Hilfe von MD-Simulationen auf atomarer Ebene zu untersuchen. Betrachtet wurden die 14-mer RNA-Hairpins, uCACGg und cUUCGg. Die verfügbaren NMR-Strukturen zeigen, dass das uCACGg-Tetraloop auffallend ähnlich in der gesamten Geometrie und den Wasserstoffbindungen zu der experimentellen Struktur des cUUCGg-Tetraloop ist, obwohl die schließende Basenpaarsequenz der beiden Tetraloops unterschiedlich sind. Trotz beachtlicher struktureller Ähnlichkeit unterscheiden sich allerdings die uCACGg und cUUCGg Tetraloops in Funktionalität und Thermostabilität. Zunächst orientiert sich unser erstes Bemühen an der Frage nach einem guten Modell für RNA-Hairpins und Simulationsbedingungen, um die zu untersuchenden RNA-Hairpins in Wasser möglichst realitätsnah zu simulieren. Erstens werden drei Versionen des biomolekularen AMBER-Kraftfelds geprüft, indem man die 60 ns Simulationen des 14-mer uCACGg-Hairpins durchführt. Die simulierten strukturellen Eigenschaften und Atomfluktuationen zeigen hohe Ähnlichkeiten in den drei Kraftfeldern. Darüber hinaus stimmen die von MD-Simulationen berechneten Atomkernabstände mit den experimentellen NMR-Daten gut überein. Die gute Übereinstimmung zwischen den Simulationen und den strukturellen NMR Daten belegt die Fähigkeit des AMBER-Kraftfelds zur Beschreibung der strukturellen Eigenschaft von kleinen RNA-Hairpins. Anschließend werden die Einflüsse der Methoden, welche die langreichweitigen, elektrostatischen Wechselwirkungen beschreiben, auf die strukturellen Eigenschaften untersucht. Insbesondere werden die Ergebnisse der Reaktionfeld-Methode mit denen der Particle Mesh Ewald (PME)-Methode verglichen. Es zeigt sich, dass die PME-Methode die elektrostatischen Wechselwirkungen am besten beschreibt, auch wenn die Simulationen der beiden Methoden Ähnlichkeit in der Struktur-Stabilität und der Atomfluktuation bei niedriger Natriumkonzentration aufweisen. Drittens wird der Kationseffekt auf die RNA-Stabilität untersucht. Betrachtet wurden zwei unterschiedliche Kationen (ein- und zweiwertig) und verschiedene Konzentrationen. Die Simulationen weisen darauf hin, dass sich die Metallionen in der Affinität zum RNA-Hairpin unterscheiden, wenn Na+ und/oder Mg2+ als Gegenionen verwendet werden. Weiterhin wird gezeigt, dass sich die bevorzugten Positionen der Na+-Ionen in der großen Furche (major groove) des RNA-Hairpins befinden. Insbesondere die Anlagerungsort der Na+-Ionen liegen in der Nähe des schließenden Basenpaar U5-G10. Im Vergleich zu Na+-Ionen lagern sich Mg2+-Ionen sowohl an die RNA-Basen U3, A4-U11, und die Phosphat-Gruppe, als auch an das schließenden Basenpaar U5-G10 an. Bestätigt werden die Modelle und Simulationsbedingungen durch den Vergleich von Parametern, die sowohl experimentell als auch durch Simulationen ermittelt werden können. Ferner erlauben MD-Simulationen Einblick in das System, indem sie detallierte Konformations- und andere Verteilungen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurden die Einflüsse der Loopsequenz und des schließenden Basenpaares auf die Verteilung der Konformationen, der internen Bewegungen, und auf die Thermostabilität von zwei RNA-Hairpins mit Hilfe dieser Modelle untersucht. Zunächst wurden die strukturellen Eigenschaften bei Raumtemperatur ausgewertet. Die starken strukturellen Ähnlichkeiten und die gute Übereinstimmung mit NMR-Daten bestätigen die Hypothese, dass die zwei Tetraloops zur gleichen “erweiterten” RNA-Familie gehören. Diese zwei Hairpins haben ähnliche Lösemittelzugängliche Oberflächen (solvent accessible surface), wobei deren Lösemittel zugänglichen funktionellen Gruppen unterschiedlich sind. Weiterhin weist das uCACGg-Hairpin eine stärkere Tendenz auf Wasserstoffe abzugeben als das cUUCGg-Hairpin, was in den unterschiedlichen Bindungsaffinitäten zwischen diesen Hairpins und der viralen Protease begründet liegt. Darüber hinaus wurde der Faltungs- und Entfaltungsprozess mit Hilfe der Replica-Exchange-Molekulardynamik-Simulationen untersucht. Diese Untersuchung zielt auf das bessere Verständnis der unterschiedlichen Thermostabilität der Hairpins, indem sie die möglichen Zwischenprodukte im atomaren Detail liefern. Sowohl experimentell als auch von den MD-Simulationen ergibt sich eine Differenz in den Schmelztemperaturen der beiden Hairpins von ungefähr 20 K. Allerdings sind die von MD beobachteten Schmelztemperaturen 20 % höher als die von Experiment zu ansehende Wert. Die Ergebnisse machen deutlich, dass die Schmelztemperaturdifferenz nicht auf die Unterschiede in der Sequenz, in der Struktur, oder in der Dynamik der Loops zurückführen sind, sondern auf die Unterschiede der Basenpaaren in den Stämmen. Weiterhin wird gezeigt, dass sich das uCACGg-Hairpin einerseits kooperativ entfaltet, und die Entfaltung des cCACGg-Hairpins anderseits weniger kooperativ stattfindet. Um die schnelle interne Dynamik der uCACGg- und cUUCGg-Hairpins zu untersuchen, erlauben die Simulationen von 50 ns eine akurate Beschreibung der schnellen internen Bewegung der RNA-Hairpin, obwohl der den Hairpins zugängliche Konformationsraum nicht vollständig abgedeckt wird. Die NMR-Relaxationsparameter, die mit Hilfe der MD-Simulationen zurückgerechnet wurden, bestätigen das Modell und die Simulationsbedingungen der MD-Simulationen. Im Hinblick auf die Übereinstimmung kann man den besten Ansatz zur Berechnung der NMR-Ordnungsparameter bestimmen. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Ansätze angewandt, nämlich das Fitting von 100 ps auf modellfreiem Ansatz nach Lipari-Szabo, equilibrium average, und das Gaussian Axial Fluctuation (GAF)-Modell. Die zwei letzteren können nur qualitativ mit den experimentellen Daten übereinstimmen. Die NMR-Ordnungsparameter können mit Hilfe des Modells von Lipari-Szabo richtig ermittelt werden, wenn sich die interne Bewegung in kleineren Zeitskalen als zur Gesamtbewegung vollzieht. Vorausetzung für die Berechnung dieses Modells ist aber, dass das Fitting der internen Korrelationsfunktionen nur auf den ersten Teil von 100 ps der Korrelationsfunktionen eingesetzt wird. Die berechneten Ordnungsparameter deuten auf ein unterschiedliches Verhalten der beiden Hairpins besonders im Loop-Bereich hin. Die konformationelle Umordnung, die beim UUCG-Loop beobachtet wurde, tritt beim CACG-Loop nicht ein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es durch den Einsatz von MD Simulationen ermöglicht wird, die strukturellen und dynamischen Eigenschaften der RNA-Systeme auf atomarer Ebene zu untersuchen. Als Schlussfolgerung zeigt diese Doktorarbeit, dass sich die Studie der konformationell Dynamik der RNA-Systeme durch die Kombination aus MD-Simulation und NMR-Spektroskopie sowie der Leistungsfähigkeit der MD-Simulationen, die die interne Bewegungen deutlich beschreiben können, untersuchen lässt.
Struktur und Bindungsverhalten der N-terminalen p85-src-homology-2-Domäne mittels NMR-Spektroskopie
(2006)
Die primäre Funktion der Haut ist die Abgrenzung des Körpers gegenüber der Umwelt, wodurch der Organismus vor destruktiven Einwirkungen (Xenobiotika, Mikroorganismen, UV-Licht) geschützt wird. Neben wichtigen sensorischen Funktionen ist die Haut außerdem beteiligt an der Regulation von Körpertemperatur sowie Wasserhaushalt und dient als wichtiges Sozialorgan. Da die Verletzung der Haut demnach schwerste Folgen für den Organismus hat, ist die Wundheilung ein essentieller Prozeß zur Aufrechterhaltung der Unversehrtheit der Haut. Der Prozeß der Wund heilung läßt sich in vier Phasen unterteilen (Koagulation, Entzündungsphase, Proliferationsphase, Remodellierungsphase), die zeitlich und räumlich überlappen (Moulin, 1995; Singer and Clark, 1999). ...
In der vorliegenden Arbeit wurden selbstanordnende Monolagen (SAMs) entwickelt, welche als gassensitive Schichten auf Goldoberflächen mit kanzerogenem Benzol reversibel wechselwirken. Der Fokus lag dabei auf elektronenarmen Systemen und insbesondere auf hochfluorierten Aromaten. Insgesamt wurden 18 neuartige SAM-Präkursoren mit Substituenten, die starke Dipolmomente induzieren, hergestellt, die mit Hilfe von Thiolat- bzw. Selenolat-Ankergruppen an Goldoberflächen angebunden wurden. Die Charakterisierung dieser Schichten erfolgte mit diversen oberflächenanalytischen Methoden, wie Ellipsometrie und Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie (IRRAS). Für die Erforschung der Selektivität und Sensitivität der präparierten Monolagen wurden Austrittsarbeitsänderungen mit Hilfe einer KELVIN-Sonde gemessen und aus diesen Erkenntnissen systematische Veränderungen an den sensoraktiven Molekülen vorgenommen. So wurden der Fluorierungsgrad des aromatischen Systems, die Kettenlänge des Spacers sowie weitere vielversprechende Strukturmotive untersucht. Insbesondere hochfluoriere Derivate mit CF3-Substituenten zeigten die höchsten Sensitivitäten gegenüber Benzol. Weiterhin wurde ein neues Infrarot-Messprinzip entwickelt und etabliert, welches in situ Messungen während eines Überleitens gasförmiger Analyten ermöglichte. Diese Ergebnisse belegen eine Interaktion zwischen Analyten und Monolage.
Ein weiteres Projekt befasste sich mit elektronenarmen aromatischen Monolagen, die über Cystamin-Einheiten an Goldoberflächen angebunden wurden, sich aber in den dipolaren Kopfgruppen unterschieden. Dieses Vorgehen ermöglicht die Herstellung von SAMs gleicher Packungsdichten, sodass lediglich die unterschiedlichen Substituenten die elektronischen Eigenschaften beeinflussen. Die resultierenden Monolagen wurden mittels mit Rastertunnelmikroskopie, Ellipsometrie, IRRAS sowie Wasserkontaktwinkel-Goniometrie untersucht. Durch eine relativ einfache Veränderung der Kopfgruppe, wobei F3C , F3CS, H3C- sowie NC-Reste eingeführt wurden, war es möglich, die Austrittsarbeit einer Goldoberfläche in einem Bereich von 4.9 bis 5.6 eV einzustellen. Zusätzlich konnte ein gemischtes Disulfid synthetisiert werden, welches eine echte gemischte SAM auf der Goldoberfläche bildete. Dieses Konzept könnte in Zukunft eine noch präzisere Modifizierung der Austrittsarbeit zulassen, was die Entwicklung von effizienteren elektronischen Bauelementen auf Basis von organischen n Typ-Halbleitern ermöglicht.
Abschließend wurden teilfluorierte Benzonitril-Derivate mit Thiolat- bzw. Selenolat-Ankergruppen erforscht, welche als SAMs Informationen über den dynamischen Ladungstransport lieferten. Die Präkursoren unterscheiden sich lediglich im Fluorierungsmuster, welches das Dipolmoment der Gesamtstruktur beeinflusst. Die hergestellten Monolagen wurden mit einer Vielzahl oberflächenanalytischer Methoden (IRRAS, Ellipsometrie, Röntgenphotoelektronen- sowie Röntgen-Nahkanten-Absorptions-Spektroskopie) charakterisiert, die alle die Bildung geordneter SAMs belegten und auf eine eher aufrechte Orientierung der Moleküle auf der Oberfläche hindeuteten. Die Bestimmung der Elektronentransfer-Zeiten mit Hilfe der sogenannten core-hole-clock-Methode zeigte überraschenderweise, dass durch eine Änderung des Substitutionsmusters der Fluoratome der Elektronenübergang nicht beeinflusst werden. Dementsprechend hat das Dipolmoment innerhalb des molekularen Gerüsts keinen signifikanten Einfluss auf die Elektronentransfer-Dynamik.
Lichtsensitive Proteine bzw. Photorezeptoren eignen sich hervorragend für das Studium des Zusammenhangs von Proteinstruktur und –funktion. Lichtrezeptorproteine werden leicht durch Licht angeregt, wodurch eine gute Zeitauflösung für deren Untersuchung erreicht werden kann. Weiterhin sind sie als Signalproteine während der Etablierung des aktiven Zustandes und dessen Zerfalls großen konformationellen und strukturellen Änderungen unterworfen. Ausgehend von diesen Eigenschaften wurde bereits eine große Zahl von Lichtrezeptorproteinen genauer untersucht. Diese vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit lichtinduzierten konformationellen Änderungen in Membranproteinen. Dafür wurden drei verschiedene Systeme herangezogen: das kleine α-helikale Peptid Gramicidin A, der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin and die BLUF (blue light using FAD) Domäne des hypthetischen Membranproteins Blrp (blue-light regulated phosphodiesterase) aus E. coli. Gramicidin A (gA) ist ein aus dem Bodenbakterium B. brevis isoliertes Antibiotikum, das Transportkanäle für einwertige Kationen wie Lithium, Natrium und Kalium ausbildet. Gelöst in Detergenzmizellen, wurde für gA unerwartet eine Wechselwirkung mit Blaulicht fest gestellt (Abbildung 1). Diese Beobachtung wurde mit statischen und zeitaufgelösten NMRspektroskopischen Methoden genauer untersucht und ist in Kapitel 2 näher beschrieben. Basierend auf den gewonnenen Erkenntnissen wird postuliert, dass einer der Tryptophanreste (Trp9) eine lichtinduzierte konformationelle Änderung erfährt. Ausgehend von der Konformation in Lösung befindet sich die Seitenkette von Trp9 in einem Gleichgewicht (70:30) mit einer zweiten Konformation. Bei der zweiten Konformation handelt es sich möglicherweise um die Orientierung, die der Tryptophanrest unter Festkörper-NMR Bedingungen einnimmt. Die Lebensdauer der neuen Konformation beträgt in etwa eine Sekunde. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin ist verantwortlich für die Verarbeitung von Lichtsignalen in den Stäbchenzellen der Retina. Die Absorption eines einzelnen Photons führt zur Isomerisierung des kovalent gebundenen Chromophors 11-cis-Retinal, wodurch konformationelle Änderungen im Protein veranlasst werden. Der aktivierte Metarhodopsin II (MetaII) Zustand induziert eine Enzymkaskade und schließlich einen Nervenimpuls, das Säugern das Kontrastsehen ermöglicht. Eine große Bandbreite an hochauflösenden NMRspektroskopischen Methoden, (einschließlich zeitaufgelöster und Festkörper-NMR Methoden) wurde im Laufe dieser Arbeit angewandt, um Konformation und Dynamik von bovinem Rhodopsin näher zu untersuchen. In Kapitel 3.1 sind zu Beginn mehrere Optimierungsschritte im Hinblick auf ein kostengünstiges, isotopenmarkiertes Säugerzellenmedium beschrieben. In diesem Zusammenhang wurden mehrere Rhodopsin NMR-Proben hergestellt, wobei der Gehalt an isotopenmarkierten Aminosäuren ca. 50% betrug. Anhand dieser Proben konnte bewiesen werden dass sich mit Lösungs-NMR-Spektroskopie auch sehr große, in Detergenzmizellen stabilisierte Membranproteine (~150 kD Gesamtmasse) detailliert studieren lassen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf den C-Terminus, für den nach sequentieller Zuordnung (Abbildung 2a) und heteronuklearern Relaxationsmessungen ein Mobilitätsverhalten bestimmt wurde, das dem mittelgroßer Proteine ähnelt. Des Weiteren konnten keinerlei definierte Strukturelemente innerhalb des C-Terminus identifiziert werden, u.a. durch einen Vergleich mit eines 19mer Peptids, dessen Primärsequenz des Rhodopsin C-Terminus entspricht (Abbildung 2a und 2b). In Kapitel 3.2 wird die nichtinvasive Zuordnung der Rückgratresonanzen aller fünf Trytophane mit Hilfe einer Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR beschrieben. Dazu wurden verschiedene Rhodopsinproben hergestellt, die alle möglichen 13C’i-1-Carbonyl/15Ni-Tryptophan isotopenmarkierten Amidpaare enthielten. Eine Teilzuordnung der Tryptophanindolsignale konnte in Lösung durch Protonen-/Deuteriumaustausch und heteronukleare Relaxationsmessungen erreicht werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR-Spektroskopie sehr gut geeignet ist um komplementäre Informationen zu strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Rhodopsin zu liefern. Fehlende Zuordnungen in den Lösungspektren konnten durch den Verglich mit Festkörperspektren ergänzt werden und umgekehrt (Abbildung 3). In Kapitel 3.3 ist die erfolgreiche Adaption der zeitaufgelösten NMR-Spektroskopie für die Untersuchung des Rhodopsin MetaII Zerfalls in vitro beschrieben. Die zeitaufgelösten protonendetektieren NMR-Experimente wurden mit unmarkiertem, in Detergenzmizellen stabilisiertem Protein bei verschiedenen Temperaturen aufgenommen, wobei sich die anschließende Auswertung auf die stark tieffeldverschobene Indolregion konzentrierte (Abbildung 4). Für die berücksichtigten Signale traten nach Induktion des aktivierten Zustandes deutliche chemische Verschiebungsänderungen auf, außerdem zeigten sie unterschiedlich schnellen MetaII Zerfall. Zusätzlich zu der erwarteten Zeitkonstante des MetaII Zerfalls (~6 min bei 298 K) konnte erstmalig eine zweite, ca. zehnmal langsamere Zeitkonstante bestimmt werden. Diese zweite Zeitkonstante ist möglicherweise ein Ausdruck für die langsame Entfaltung von Sekundärstrukturelementen nach dem Zerfall des Proteins in Opsin und Retinal. Die BLUF-Domänen verwenden Flavinadeninnukleotid (FAD) als Chromophor und gehören zu der Familie der Blaulichtrezeptoren. In Kapitel 4 wird die Untersuchung des lichtadaptierten Zustandes der E. coli BLUF Domäne auf Protein- und Ligandenebene mit zeitaufgelösten proton- und phosphordetektierten NMR-Experimenten beschrieben. In Abbildung 5 sind die statischen Licht- und Dunkelspektren (jeweils licht- und dunkeladaptiert) dargestellt. Im Folgenden konnte durch Beobachtung der Dunkeladaption bei verschiedenen Temperaturen die Aktivierungsenergie des Lichtzustandes bestimmt werden. Des Weiteren wurden zum ersten Mal phosphordetektierte NMR-Experimente erfolgreich angewandt, um einen biologisch relevanten Vorgang zeitabhängig näher zu bestimmen.
Das extrem thermophile Eubakterium Thermus thermophilus ist in den letzten Jahren zu einem Modell für thermophile Organismen geworden und verdankt seinen Statuszum Teil seiner hohe Wachstumsrate, den guten Zellerträgen und der konstitutivenExpression eines natürlichen Kompetenzapparates, der seine genetische Manipulation ermöglicht. Die Verfügbarkeit von kompatiblen Plasmiden und bis zu vier thermostabilen Antibiotikaresistenzmarkern konnten den Wert des Organismus in Hinblick auf biotechnologische Anwendungen noch weiter steigern und tatsächlich besteht nach wie vor ein ungebrochenes Interesse an der Struktur- und Funktionsaufklärung thermophiler Proteine. Der Focus der hier vorliegenden Arbeit richtete sich auf eine der insgesamt zwei terminalen Oxidasen der Atmungskette von T. thermophilus, die Cytochrom ba3 Oxidase. Es wurden verschiedene rekombinante Varianten des Proteins, die sich hinsichtlich der Position und Länge des verwendeten Histidin-Tags unterschieden, kloniert, exprimiert und aufgereinigt. Das Einfügen eines internen His12-Tags in einen periplasmatischen Loop zwischen den Transmembranhelices IV und V führte zu einer rekombinanten Version der Oxidase, die in ihren Eigenschaften dem nativen Wildtyp entsprach und sich durch die in dieser Arbeit etablierte Aufreinigungsstrategie relativ schnell, in guten Ausbeuten und hoher Reinheit aufreinigen ließ. Weiterhin konnten verschiedene Punktmutationen von möglicherweise am Elektronentransfer beteiligten Aminosäureresten generiert und die resultierenden Proteine aufgereinigt und über ihre enzymatische Aktivität charakterisiert werden. Eine weiterführende Charakterisierung der Mutanten erfolgte im Rahmen einer Kooperation und ist bisher noch nicht abgeschlossen. Das Herzstück dieser Arbeit machte jedoch die Definition der Transkriptionseinheit der Cytochrom ba3 Oxidase und die sich daraus ergebenden Fragestellungen aus. So konnte gezeigt werden, dass das ba3 Operon zusätzlich zu den Strukturgenen der dort kodierten Untereinheiten noch mindestens ein, höchst wahrscheinlich jedoch zwei zusätzliche Gene enthält: cbaX und cbaY. Bioinformatische Charakterisierungen ordneten CbaY der diversen Gruppe von sekundären Transportern zu, und es konnte experimentell gezeigt werden, dass seine Anwesenheit für die Expression der Cytochrom ba3 Oxidase förderlich ist. CbaX hingegen konnte über die durchgeführte Homologiesuche keine Funktion zugeordnet werden; uncharakterisierte Homologe waren einzig in der Thermaceae Gruppe zu finden. Durch Deletions- und Komplementationsstudien konnte dem Protein eine entscheidende Rolle in der Assemblierung der ba3 Oxidase bescheinigt werden. CbaX scheint eine zentrale Aufgabe bei der Häm a Insertion in Untereinheit I zu spielen und könnte, ohne Sequenzhomologie aufzuweisen, die Rolle des Surf1-Proteins übernehmen, welches in den sequenzierten Organismen der Thermaceae Gruppe nicht konserviert ist. Die homologe Expression und Aufreinigung von CbaX führte nicht zur erwarteten Ausbeute und Reinheit des Proteins, konnte aber durch immunologische Experimente eine potentielle Interaktion von CbaX und der Cytochrom ba3 Oxidase nachweisen.
The cytochrome bc1 complex or ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase (QCR) catalyses electron transfer from ubiquinol to cytochrome c in respiration and photosynthesis coupled to a vectorial proton transport across the membrane, in which the enzyme resides. In both bacteria and eukaryotic organisms, QCR participates in supramolecular assembly of membrane proteins that comprise the respiratory or photosynthetic chain. In the present work, proton transfer pathways, substrate binding and the supramolecular assembly of the respiratory chain in yeast were probed by structure-based site-directed mutagenesis and characterization of the variants. Both active sites centre P, the place of quinol oxidation, and centre N, where quinone reduction takes place, lack direct access to the bulk solvent necessary for proton release and uptake. Based on the X-ray structure, proton transfer pathways were postulated. Analysis at centre P showed, that E272 and Y132 of cytochrome b are important for QCR catalysis as indicated by increased superoxide production and lowered Cyc1p reductase activity in these variants. Pre-steady state heme reduction kinetics in combination with stigmatellin resistance indicated that charge and length of the side chain at position 272 are crucial for efficient docking of the ISP to form the enzyme substrate complex and for electron bifurcation at centre P. Variants of Y312 and F129, both residues of cytochrome b, showed an increased Km indicating participation of these residues in coordination of ubiquinol or the possible intermediate semiquinone anion radical. F129 proved to be crucial for a functional Q-cycle as indicated by respiratory negative growth phenotype and a lowered H+/e- stoichiometry of F129 variants. At centre N, the postulated CL/K and E/R proton transfer pathways are located at opposite sites of the bound ubiquinone. Variants in the surface residues R218 (cytochrome b) and E52 (Qcr7) of the E/R pathway and E82 (Qcr7) of the CL/K pathway showed instability upon purification indicating an important role of these residues for QCR integrity. The slowed down centre N reduction kinetics in H85 (CL/K), R218 and N208 (both E/R) variant was attributed to a destabilised semiquinone anion consistent with the observed decreased sensitivity towards the site-specific inhibitor antimycin and an increased Km. Variants of residues of both pathway, E82Q and R218M, exhibited a decreased H+/e- stoichiometry indicating a crucial role of both residue for maintaining a working Q-cycle and supporting the proposed protonation of the substrate via the Cl/K and the E/R pathway. Long-range interaction between centre N and centre P were observed by altered reduction kinetics of the high potential chain and increased superoxide production in the centre N variants. The role of the cation-pi-interaction between F230 of Cyt1p and R19 of cytochrome c in binding of the redox carrier to QCR was analysed. In F230L hydrophobic interaction were partially lost as was deduced from the ionic strength dependence of Cyc1p reductase activity and Cycp1 binding, as detected by ionic strength sensitive Kd and Km for Cyc1p. The decreased enzymatic rate of F230W could be explained by a disturbed binding of Cyc1p to the variant enzyme. F230 may influence the heme mid point potential and thereby the electron transfer rate to Cyc1p. Reduction of Cobp via both centre P and centre N was disturbed suggesting an interaction between high and low potential chain. Supramolecular association between QCR and cytochrome c oxidase (COX) in yeast mitochondria was probed by affinity chromatography of a his-tagged QCR in the presence of the mild detergent digitonin. In comparison to purification with laurylmaltoside, the presence of both QCR and COX subunits was detected in the elution fractions by SDS-PAGE, Cyc1p reductase and TMPD oxidase activity assays and immunoblot analysis. The CL-dependent formation of the supercomplex between QCR and COX was analysed by replacement variants in the CL-binding site of QCR in CL containing and CL free environment. With an increasing number of replacements of the three lysines the CL-binding pocket supercomplex formation was not abolished, when CL is present as shown by BN-PAGE analysis. This was supported by the synergetic decrease in enzyme activity for both enzymes upon increased number of replacements. In the CL-free environment, no supracomplex formation was observed for a wildtype CL binding site. By replacements of two lysines in the CL-binding pocket, supercomplex formation could be recovered as revealed by BN-PAGE. This indicates, that CL may serve as a charge neutralizer for the lysines near the presumed interaction domain between complex III and complex IV. The obtained results for centre P provide new information of residues critical for stabilisation of ubiquinol and controlling electron short circuit reactions. The observations for centre N variants clearly support the proposed two proton transfer pathways and the role of the bound phospholipids in centre N kinetics. Variants in the Cyc1p binding site suggest a role for F230 both in Cyc1p binding and electron transfer. Clear interaction between the high and low potential chain in both Cyt1p and centre N variants strongly support long-range interactions in the complex. Studies on the supramolecular association of complex III and complex IV indicate a new role of Cl in stabilising a supracomplex.
In dieser Arbeit wurde der Gentransfer von Todesliganden als Ansatz zur Tumor-Gentherapie untersucht. Dazu wurde ein lentiviraler Vektor der zweiten Generationverwendet, der die Todesliganden CD95L oder TRAIL sowie das Markergen EGFP exprimiert. Dies ist die erste Beschreibung von CD95L- oder TRAILexprimierenden lentiviralen Vektoren. Der TRAIL-exprimierende Vektor erwies sich als geeignet für die therapeutische Induktion von Apoptose in humanen Tumorzelllinien auch bei geringen Vektordosen. Die Transduktion mit diesem Vektor bei niedriger MOI führte zu Todesrezeptor-spezifischer Induktion von Apoptose. Diese wurde ausschließlich durch membranständiges TRAIL bei Zell-Zell-Kontakt vermittelt. Die transduzierten Zellen waren zudem in der Lage, bei Kontakt mit nichttransduzierten Zellen in diesen Apoptose auszulösen. Durch den TRAIL-Gentransfer wurde jedoch spezifisch in den transduzierten Zellen Resistenz gegen TRAIL-induzierte Apoptose ausgelöst, während die CD95- oder Cisplatin-induzierte Apoptose nicht beeinflusst war. Dies führte zum Auswachsen einer vollständig TRAIL-resistenten Population. Bereits 72 Stunden nach Transduktion konnten Anzeichen der Resistenz detektiert werden. Der Grund für diese Resistenzinduktion lag in einer spezifischen Blockade der DISC-Bildung und Caspase-8-Aktivierung durch die TRAIL-Todesrezeptoren. Die Signaltransduktion durch den sehr ähnlichen CD95-Signalweg war gänzlich unbeeinflusst. Durchflusszytometrische und proteinbiochemische Untersuchungen der Expression von TRAIL-R1 und TRAIL-R2, sowie die Untersuchung der mRNA-Expression dieser Rezeptoren ergaben, dass beide TRAIL-Todesrezeptoren noch synthetisiert, jedoch intrazellulär zurückgehalten wurden. In fluoreszenzmikroskopischen Versuchen konnte gezeigt werden, dass TRAIL-R2 intrazellulär in einem Komplex mit TRAIL vorlag, der sich im Bereich des ER/Golgi-Apparates befand. Diese Ergebnisse belegen, dass intrazelluläre Interaktion von TRAIL mit seinen Rezeptoren zur Retention dieser Proteine in der Zelle und damit zur Resistenzentwicklung führte. Bei Versuchen zur in vivo-Gentherapie durch lentivirale TRAIL-Expression in humanen Tumortransplantaten auf Nacktmäusen wurde nur ein transienter Effekt erzielt. Es konnte gezeigt werden, dass mit Vektorpartikeln assoziiertes TRAIL-Protein in den Tumoren Apoptose auslöste. Diese Induktion von Apoptose führte zu einer Wachstumsverzögerung. Dadurch wurde jedoch gleichzeitig eine effiziente Transduktion der Tumorzellen mit dem TRAIL-exprimierenden Vektor und ein langfristiger Effekt der TRAIL-Expression verhindert. Diese Ergebnisse zeigen, dass lentiviraler Gentransfer mit konstitutiv TRAIL-exprimierenden Vektoren ungeeignet zur in vivo-Transduktion von Tumoren ist. Gleichzeitig belegen die Ergebnisse der Transduktion mit einem Kontrollkonstrukt einen effizienten Gentransfer. Der hier charakterisierte Resistenzmechanismus ist zuvor nicht beschrieben worden und stellt eine neuartige Form der Therapie-induzierten Resistenz dar. Die proapoptotische Gentherapie durch konstitutive TRAIL-Expression in Tumoren muss nach diesen Ergebnissen neu bewertet werden. Der lentivirale Gentransfer in Tumore in vivo läuft prinzipiell effizient ab. Bei Verwendung eines regulierbaren Expressionssystems und in Kombination mit Suizidgenen könnte eine therapeutische Nutzung des lentiviralen TRAIL-Gentransfers möglich sein.
Bestimmung der Lösungsstruktur von Rinder-Adrenodoxin durch Auswertung hochaufgelöster NMR-Spektren
(2001)
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der Strukturen von RinderAdrenodoxin im oxidierten und im reduzierten Zustand. Die rekombinante Form dieses Elektronentransportproteins aus 128 Aminosäuren und dem [2Fe2S]EisenSchwefel Cluster mit einer Molmasse von 14,4 kDa wurde in E. coli exprimiert. Die hergestellten Proben wurden entweder mit 15 N oder 15 N, 13 Cangereichert, was den Einsatz einer breiten Palette heteronuklearer NMRExperimente ermöglichte. Nach der Zuordnung individueller Werte der chemischen Verschiebung für die NMRaktiven Kerne konnten durch 15 N und 13 Ceditierte dreidimensionale NOESYExperimente 1800 strukturrelevante Interprotonenabstände qualitativ bestimmt werden. Insgesamt konnten 70 Prozent der Resonanzen der NMR aktiven Kerne der jeweiligen Proteinzustände zugeordnet werden. Bedingt durch den paramagnetischen Einfluß des EisenSchwefelClusters waren durch enorme Linienbreiten und sehr schnelle T 1 Relaxationszeiten 30 Prozent der zu erwartenden Signale des Proteins nicht detektierbar. Zusätzlich konnten durch die Anwendung eines ct( 15 N, 1 H)HSQC Experiments weitere 18 Abstandsparameter von Amidprotonen im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster, die aber gerade noch detektiert werden konnten, zu dem jeweiligen näheren Eisenkern gewonnen werden. Für die Strukturrechnung mußte der EisenSchwefelCluster künstlich mit der Aminosäure C46 verbunden werden, da das Programm DYANA keine Eisen Atome erkennt. Anschließend wurde dieser 'künstliche' Aminosäurerest neu benannt (CYSC). Diese neue Aminosäure wurde dann nach Energieminimierung in die DYANA Bausteinbibliothek eingebracht. Es zeigte sich, daß der EisenSchwefelCluster die Struktur wie eine 'Klammer' zusammenhält. Ohne die Einbindung des EisenSchwefelCluster kommt es nach der Strukturrechnung zu keiner Struktur, sondern zu einem ungeordneten 'Knäuel'. Bei der Interpretation der Strukturensembles wurde deutlich, daß Rinder Adrenodoxin ein relativ rigides Protein ist. Scheinbar hohe flexible Bereiche im Protein mußten korreliert werden mit den Bereichen des Proteins, die aufgrund von fehlenden Zuordnungen nicht gut genug definiert werden konnten. Es ist somit nicht definitiv zu bestimmen, woher diese Abweichung in den Strukturen herrührt. Allerdings wurde bei der Betrachtung von Aminosäureresten in der Wechselwirkungsdomäne deutlich, daß an den Positionen der Aminosäurereste D72, E73, D76 und D79 es zu Bewegungen beim Übergang aus dem oxidierten in den reduzierten Zustand kommen muß, da speziell die Aminosäurereste D72 und E73 ihre Position dramatisch verändern. Entsprechende Änderungen der Werte der X1 Diederwinkeleinstellungen wurden beobachtet und lokale Ramachandran Diagramme ergeben sich aus den Rechnungen. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß im reduzierten Zustand S112 mit einer T 1 Relaxationszeit von 62,5 ms im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster liegen könnte. Ein Hinweis darauf ist auch die Änderung der Geometrie des C Terminus, da im oxidierten Zustand dieser gerade vom Proteinkörper wegweist, während im reduzierten Zustand das Cterminale Ende sich in Richtung Proteinkörper biegt. Bisher wurde angenommen, daß dem CTerminus keine funktionelle Rolle zukommt. Die Struktur des Adrenodoxins wurde nach der Distanzgeometrierechnung unter Berücksichtigung aller experimenteller Daten erhalten. RinderAdrenodoxin ist klassifiziert als ein (alpha beta)Protein welches 22% betaFaltblatt, 17% alphaHelix und 6% 3 10 Helix besitzt. Für den oxidierten und den reduzierten Zustand konnten jeweils 5 betaFaltblätter und 4 Helices identifiziert werden. Beim oxidierten Zustand erstrecken sich die 5 betaFaltblätter auf die Aminosäurereste 812, 1822, 5759, 8889 und 103106, während beim reduzierten Adrenodoxin sie sich auf die Aminosäurereste 612, 2124, 5758, 8889 und 103106 erstrecken. Die 4 identifizierten Helices erstrecken sich im oxidierten Zustand auf die Reste 2935, 6466, 7229 und 98100. Die 4 Helices für den reduzierten Zustand werden durch die Reste 3336, 6164, 7275 und 98100 charakterisiert. Der EisenSchwefelCluster ist kovalent an die vier CysteinReste 46, 52, 55 und 92 gebunden. Mit einem mittleren globalen RMSDWert der Rückgratatome zur Mittelstruktur für das oxidierte Adrenodoxin von 0,94 Å und für das reduzierte Andrenodoxin von 1,53 Å sind die Anforderungen an relativ gut aufgelöste Strukturen erfüllt. Die hier bestimmten Strukturen entsprechen in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit der Auflösung von 2.0 Å (Programm PROCHECK) für den reduzierten und den oxidierten Zustand von RinderAdrenodoxin und sind somit zufriedenstellend aufgelöst.
Ziel der Arbeit war es, die strukturellen Eigenschaften einer flüssigen Vorstufe einer Mullitkeramik mit Hilfe der NMR-Spektroskopie zu untersuchen. Die fertige Keramik soll später im Triebwerksbau in der Luft- und Raumfahrttechnik eingesetzt werden. Dazu wurden NMR-Messungen an den Kernen 1 H , 13 C, 27 Al und 29 Si durchgeführt. Als Experimente kamen dabei sowohl eindimensionale als auch zweidimensionale Methoden der NMR-Spektroskopie zum Einsatz. Zur Bildung von Strukturhypothesen wurden verschiedene Modellsysteme im Rechner simuliert. Eine besondere Herausforderung bei der Messung und Interpretation der Spektren stellte die hohe Viskosität der verwendeten Proben dar. Diese hohe Viskosität der Proben führte zu einer starken Verbreiterung der Resonanzlinien in den NMR-Spektren und zu den gezeigten Schwierigkeiten bei den Diffusionsmesungen. Die in der Literatur beschriebene strukturelle Vielfalt der Aluminiumalkoholate konnte nicht nur, wie in der Literatur bekannt, mit Hilfe von Aluminiumspektren, sondern auch über Protonen und Kohlenstoffspektren nachgewiesen und beschrieben werden. Insbesondere konnten Struktureinheiten jenseits der bekannten dimeren, trimeren und tertameren Strukturen der Aluminumalkoholate beschrieben werden. Das trimere Aluminiumsekundärbutylat steht mit einer dimeren Form im Gleichgewicht. Durch Temperaturerhöhung wird dieses Gleichgewicht in Richtung der dimeren Form verschoben. Im Falle der Verbindung [Al(OBu) 2n (iP rEtO) n ] konnte die direkte Nachbarschaft der 2-Butanol und iso-Propoxyethanolreste im Komplex über Signale im ROESY-Spektrum aufgezeigt werden. Es konnte eine sehr exakte und reproduzierbare Methode zur Bestimmung von Diffusionskonstanten in viskosen, gelartigen Lösungen mittels NMR-Messungen gefunden und erfolgreich auf die zu beobachtenden Systeme adaptiert und verwendet werden. Nur mit Hilfe dieser Methode war es möglich, den supramolekularen Charakter der Vorstufen einer Mullit-Keramik nachzuweisen. Insbesondere konnte gezeigt werden, daß das vorgestellte System eine hochgeordnete Struktur aufweist, und daß die einzelnen molekularen Einheiten über nicht kovalente Wechselwirkungen miteinander verbunden sind.
The transcription factor p63 is part of the p53 protein family, which consists of three members, p53, p63 and p73. P63 shares structural similarity with all family members, but is associated to different biological functions than p53 or p73. While p53 is mainly linked to tumor suppression and p73 is connected with neuronal development, p63 has been connected to critical biological roles within ectodermal development and skin stem cell biology as well as supervision of the genetic stability of oocytes. Due to its gene structure p63 is expressed as at least six different isoforms, three of them containing a N-terminal transactivation domain. The isoforms that are of biological relevance both have a C-terminal inhibitory domain that negatively regulates the transcriptional activity. This inhibitory domain is supposed to contain two individual components of which one is internally binding and masking the transactivation domain while the other one can be sumoylated. To further investigate this domain a mutational analysis with the help of transactivation assays in SAOS2 cells was carried out to identify the critical amino acids within the inhibitory domain and the impact on transcriptional activity of TAp63alpha, the p63-isoform which is essential for the integrity of the female germline. The results of these experiments show that a stretch of approximately 13 amino acids seems to be important for the regulation of transcriptional activity in TAp63alpha, due to the increased transcriptional activity occurring in this region after mutation. Additional experiments showed that this mechanism is distinct from sumoylation, which seems to have only implications for the intracellular level of TAp63alpha. As a conclusion, the C-terminus of the Tap63alpha is essential for two different mechanisms, which control the transcriptional activity of the protein. Both regulatory elements are independent from each other and can now be restricted to certain amino acids. Activation of the wild type protein might take place in the identified region via post-translational modification. Furthermore an inhibition assay was carried out to test if the same region might have implications on the second biological relevant isoform deltaNp63alpha. The results show that the same amino acids which show an impact on transcriptional activity in Tap63alpha lead to a significant change in functional behaviour of deltaNp63alpha. There is a possibility that both proteins are regulated with opposite effects via the same mechanisms, based at the C-terminus of the p63alpha-isoforms. In both cases a modification of these residues could lead to a more opened conformation of the protein with consequences on promoter binding, which can be even important for deltaNp63alpha with respect to promoter squelching. Both alpha-isoforms seem to be regulated via the C-terminus and to elucidate if that is also the case for TAp63gamma a deletion analysis was carried out. The results show that there are also amino acids within the C-terminus of TAp63gamma, which have implications on the transcriptional activity of the protein. Therefore the C-terminus seems to play a major role for regulation of diverse p63 isoforms.
In dieser Arbeit werden Projekte beschrieben, in denen das Adsorptionsverhalten von Proteinen und Bakterien an verschiedene Materialoberflächen manipuliert wird.
Durch die Reaktion verschiedener oxidischer Oberflächen mit Glycidol konnten biorepulsive Polyglycerolschichten erzeugt werden. Für die Herstellung dieser Polyglycerolschichten wurden zwei unterschiedliche Verfahren entwickelt und untersucht. Die erste Methode beruht auf der Bildung einer aminoterminierten Monolage auf Silicium-Oberflächen, an der in einem zweiten Schritt die Polymerisation von Glycidol durchgeführt wird. Die Dicke der angebundenen Polyglycerolschicht ist abhängig von der Beschichtungsdauer, wobei die dicksten Schichten bis zu 98% der Bakterienadhäsion unterdrücken können. Das zweite Verfahren ist die direkte Anbindung von stabilen Polyglycerol-Beschichtungen an Silicium-, Aluminium- oder Stahl-Oberflächen. Je größer die abgeschiedene Polyglycerolmenge ist, desto höher ist die Biorepulsivität der Schicht, was durch Adsorptionstests mit Proteinen und ermittelt wurde.
Polyglycerolschichten eignen sich besonders gut für die nachträgliche Modifizierung. So konnten beispielsweise mittels Elektronenstrahlen laterale Strukturierungen der Polyglycerol-beschichteten Oberflächen erfolgreich durchgeführt werden. Sensorisch aktive Moleküle wie Ethylendiamintetraessigsäure oder Biotin konnten im Rahmen dieser Arbeit nachträglich an Polyglycerolschichten angebunden werden. Die Aktivität der Bindungsstellen nach der Anbindung an die Oberfläche konnte dabei durch spezifische Erkennungsereignisse nachgewiesen werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden selbstanordnende Monoschichten mit Oligoethylenglycol (OEG)-Kopfgruppen und Thiolat-Ankergruppen verwendet, um lateral strukturierbare, biorepulsive Schichten auf Gold zu erzeugen. Es wurde untersucht, ob derartige OEG-Monolagen kontrolliert durch langwelliges UV-Licht (390 nm) abgebaut werden können, um proteinbindende und proteinrepulsive Bereiche auf einer Substrat-Oberfläche zu generieren. Die Bestrahlung mit UV-Licht bewirkte die Oxidation und Abspaltung der Ethylenglycol-Einheiten, wodurch die unspezifische Adsorption von Proteinen erfolgen kann. Zusätzlich konnten Photooxidations-Reaktionen an der Thiolat-Ankergruppe nachgewiesen werden, welche die Ablösung des SAM-Bausteins zur Folge haben.
Für den Einsatz von Lithographie-Techniken in mikrofluidischen Anlagen wurde das Abbauverhalten der biorepulsiven Monolage bei der Bestrahlung unter Wasser untersucht. In Abwesenheit von molekularem Sauerstoff kommt es hier lediglich zur Spaltung der Etherbindung zwischen den Ethylenglycol-Einheiten. Die Beobachtung, dass die An- bzw. Abwesenheit von molekularem Sauerstoff zu zwei unterschiedlichen Abbaumechanismen führt, kann für die Feinabstimmung der Oberflächenbeschaffenheit und somit der Proteinanlagerung genutzt werden.
Biorepulsive OEG-Monolagen können auch dazu verwendet werden, um gezielt bestimmte Biomoleküle anzulagern. Dazu können die Monolagen mit Erkennungsstellen ausgestattet werden, welche die spezifische Anbindung einer Biomolekül-Spezies ermöglichen. Gerade bei der Detektion von großen Biomolekülen oder Mikroorganismen spielt jedoch nicht nur die chemische Zusammensetzung, sondern auch die Ausrichtung der Bindungsstelle eine entscheidende Rolle. Für die Untersuchung des Orientierungseinflusses wurden Moleküle verwendet, die neben einer Mannose-Einheit als Bindungsstelle für Bakterien auch eine Azobenzol-Gruppe, welche die strahlungsinduzierte reversible Schaltung der Konformation ermöglicht, tragen. Bakterien-Adhäsionstests zeigten, dass sich die Orientierung der Mannose-Einheit auf die Anbindung der Bakterien auswirkt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden neuartige Methoden zur Herstellung, Charakterisierung und Strukturierung biorepulsiver und biosensorischer Schichten entwickelt. Die dadurch gewonnenen Erkenntnisse sind von bedeutender wissenschaftlicher Relevanz und ermöglichen die potentielle industrielle Anwendung der entwickelten Methoden im Kontext der Material- und Biotechnologie sowie der Nanofabrikation.
In dieser Arbeit wurde der neuronale Glutamattransporter EAAC1 (Excitatory Amino Acid Carrier 1), kloniert aus Rattenretina, in HEK (Human Embryonic Kidney) Zellen transient exprimiert und mit Hilfe der patch clampTechnik elektrophysiologisch untersucht. Der Glutamattransport ist gekoppelt an den Kotransport von drei Natriumionen und einem Proton und den Gegentransport von einem Kaliumion. Damit werden pro Transportzyklus zwei positive Nettoladungen in die Zelle verschoben. Zusätzlich zum Glutamattransport verfügt der EAAC1 über eine Glutamatinduzierte Anionenleitfähigkeit, die nicht thermodynamisch an den Glutamattransport gekoppelt ist und besonders deutlich bei chaotropen Anionen (wie SCN ) in Erscheinung tritt. Eine weitere Funktion des Transporters ist seine Glutamatunabhängige Leckleitfähigkeit. Mit Hilfe von Ganzzellableitungen unter definierten ionalen extra und intrazellulären Bedingungen und bestimmtem Haltepotenzial erfolgte die Charakterisierung des Glutamattransporters von der extrazellulären Seite. Eine hohe Überexpression von EAAC1 in den HEKZellen, mit einer durchschnittlichen Dichte von # 4#10 3 Transporter pro µm 2 Zellmembran, erlaubte zudem die Beschreibung des Transporters von der intrazellulären Seite, durch Messungen am insideout patch. Stationäre Messungen an EAAC1 unter kontrollierten Spannungs und ionalen Bedingungen ließen verschiedene Aussagen zu über 1) die Bindungsreihenfolge von Glutamat und den kotransportierten Ionen an den Transporter, 2) den Anteil der Anionenleitfähigkeit am Glutamatinduzierten Gesamtstrom 3) die Abhängigkeit der Glutamatunabhängigen Leckleitfähigkeit und der Glutamatabhängigen Anionenleitfähigkeit von der Protonen und Natriumkonzentration und 4) die Identifikation des Ladungsträgers beim EAAC1assoziierten Leckstrom. Bei den durchgeführten vorstationären Messungen handelte es sich meist um SubstratsprungExperimente mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse von #CNBcaged Glutamat. Damit konnte 1) der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im Transportzyklus ermittelt werden, 2) Geschwindigkeitskonstanten verschiedener Teilreaktion im Transportzyklus von EAAC1 abgeschätzt werden und 3) die Spannungsabhängigkeit von Teilreaktionen identifiziert werden. Die Kombination von stationären und vorstationären Messungen mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse sowie die Kombination von Ganzzellableitungen und insideout patches ermöglichte damit eine umfassende kinetische Untersuchung der verschiedenen Funktionen von EAAC1 und führten zu dem im folgenden beschriebenen Transportmodell. EAAC1 bindet auf der extrazellulären Seite zunächst ein Natriumion, wobei die Natriumbindungsstelle im elektrischen Feld der Membran liegt (# 25#30 %). Dieser Na beladene Transporterzustand ist assoziiert mit einem Glutamatunabhängigen Leckstrom, der von Anionen getragen ist. Der Na Bindungsreaktion schließt sich eine elektroneutrale Protonenbindung an. Der apparente pKWert des Protonakzeptors in EAAC1 liegt bei # 8, sodass unter physiologischen Bedingungen EAAC1 hauptsächlich in seiner protonierten Form vorliegt. Die nachfolgende Glutamatbindung (KD # 50 µM) ist ebenfalls spannungsunabhängig und erfolgt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 2#10 7 M #1 s #1 . Sie löst eine elektroneutrale Konformationsänderung aus, die in einem Zeitbereich von 0,5#1 Millisekunde stattfindet und damit langsam ist im Vergleich zu den anschließenden elektrogenen Na Bindungsreaktionen. Der vollständig beladene Transporters transloziert in einem spannungsabhängigen Prozess (# 60#65 % des elektrischen Felds) Glutamat über die Membran mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 800 s #1 bei einem physiologischen Membranpotenzial von #80 mV. Der GlutamatTransportprozess ist mit der Glutamatinduzierten Anionenleitfähigkeit assoziiert, wobei sich beim GlutamatEinwärtstransport ein Verhältnis zwischen Transport und Anionenstrom (von SCN # ) von 1 zu 4 ergab, während es beim GlutamatAuswärtstransport bei 1 zu 1,5 lag. Die Dissoziationsfolge auf der intrazellulären Seite wurde nur für den Protonen-GlutamatKotransport bestimmt und war in umgekehrter Reihenfolge zur extrazellulären Seite. Verschiedene Mechanismen fördern auf der zytosolischen Seite die Dissoziation des Glutamates, bzw. verhindern den GlutamatAuswärtstransport. So führt die Änderung der Zugänglichkeit des Protonakzeptors zur zytosolischen Seite zu einer Verschiebung des apparenten pKWertes zu # 6,5. Damit liegt EAAC1 unter physiologischen Bedingungen auf der intrazellulären Seite hauptsächlich deprotoniert vor, was die Glutamatdissoziation fördert. Ebenso ist die Affinität mit einem 45fach erhöhten K M Wert im Vergleich zur extrazellulären Seite stark herabgesetzt. Die Relokation des Transporters erfolgt nach der Bindung eines Kaliumions und stellt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 100 s #1 (bei einem Membranpotenzial von #80 mV) den hauptsächlich geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Transportzyklus dar. Bei der Relokation handelt es sich um einen elektrogenen Prozess (# 70#75 % des elektrischen Felds), wobei negative Ladungsträger über die Membran verschoben werden. Daher muss der Transporter über eine Eigenladung von < #1 verfügen. Daraus ergibt sich, dass die zu transportierende Nettoladung von zwei positiven Ladungen pro Transportzyklus auf zwei Reaktionsschritte verteilt ist. Der neuronale Glutamattransporter EAAC1 verfügt damit über verschiedene Mechanismen, den Transportprozess in Richtung Glutamataufnahme in die postsynaptische Nervenzelle zu fördern, entsprechend seiner physiologischen Aufgabe, die Glutamatkonzentration im synaptischen Spalt gering zu halten.
Biophysical studies of the translation-regulating add adenine riboswitch from Vibrio vulnificus
(2017)
Bacterial gene expression can be regulated at mRNA level by cis-acting mRNA elements termed riboswitches. Riboswitches operate by conformational switching between a ligand-free and a ligand-bound state with different structures that either activate or inhibit gene expression. This PhD thesis contributes to the molecular level understanding of full-length purine riboswitches. It presents biophysical investigations on the ligand-dependent folding of the full-length translation-regulating add adenine riboswitch from the gram-negative human pathogenic marine bacterium Vibrio vulnificus (Asw). Asw has the typical bipartite riboswitch architecture with a 5’ ligand-sensing aptamer domain and a 3’ regulatory domain termed expression platform. According to the working hypothesis, Asw employs a unique thermodynamically-controlled 3-state conformational switching mechanism between an apoB, an apoA and a holo conformation to regulate translation initiation in a temperature-compensated manner. The two apo conformations are the putative translation-OFF states and the holo conformation is the putative translation-ON state of Asw. In the main project of this PhD thesis, an integrated nuclear magnetic resonance (NMR) and smFRET spectroscopic study of the full-length 112-nucleotide Asw (112Asw) was performed. The adenine-dependent folding of 112Asw was monitored at the level of base pairing interactions by NMR of the RNA imino protons, and at the level of three long-range intramolecular distances by smFRET of immobilized molecules. The integrated NMR and smFRET spectroscopic study of 112Asw yielded two major findings. First, NMR and smFRET both revealed that adenine binding to 112Asw impedes apoB formation by stabilizing the apoA secondary structure in the holo conformation without modulating tertiary structural interactions between the two riboswitch domains. This highlights the central role of competitive P1 and P4 helix formation at the interface of the aptamer and the expression platform for switching the accessibility of the ribosome binding site of 112Asw. Moreover, it strongly corroborates the hypothesis that purine riboswitches in general operate according to the key principle of a spatially decoupled secondary structural allosteric switch that proceeds without ligand-induced tertiary structural interactions between the aptamer domain and the expression platform. Second, it was uncovered by smFRET that the apoA and the holo conformation of 112Asw do not adopt a single folding state at near-physiological Mg2+ concentration. Instead, apoA and holo exhibit a persistent dynamic equilibrium between substates with an undocked (U), a short-lived docked (D1; ~s) and a Mg2+-bound long-lived docked (D2; ~10 s) aptamer kissing loop motif. In the holo conformation, the fractional population of the long-lived docked substate is ~2-fold increased compared to the apoA conformation, but undocked and docked substates are still comparably stable. The here described multiple folding states of the apoA and the holo conformation might have regulatory properties that are in between the apoB translation-OFF state and the holo-D2 translation-ON state. Additonally, an integrated NMR and smFRET analysis of 127-nucleotide Asw (127Asw) is presented. Compared to 112Asw, 127Asw is 3’-elongated by 15 nucleotides of the adenosine deaminase encoding sequence of the add gene from Vibrio vulnificus. 127Asw was chosen as mRNA template for future investigations of the interaction between Asw and the 30S ribosomal subunit. The NMR spectra of 127Asw demonstrated that 127Asw has the same overall secondary structure as 112Asw. Like for 112Asw, the combined NMR and smFRET analysis of 127Asw showed that adenine binding impedes apoB formation and stabilizes a long-lived docked aptamer kissing loop fold. However, compared to 112Asw, 127Asw has a destabilized aptamer kissing loop motif and a stabilized P4 helix in the expression platform. Finally, ligand-observed studies of the transient encounter complex between Asw and the near-cognate ligand hypoxanthine are described. By competition binding WaterLOGSY NMR experiments with hypoxanthine and the adenine analogue 2,6-diaminopurine, it could be shown that hypoxanthine binds to the same binding site of 112Asw as the cognate ligand adenine. The hypoxanthine binding constant measured with the WaterLOGSY method is in the low mM range (1.8 mM) and substantially exceeds the physiological hypoxanthine concentration in E. coli (~0.3 mM), thus ruling out that hypoxanthine binding can significantly impact the translational regulation of Asw in vivo. Also, preliminary FTIR difference spectra of 13C,15N-labelled and unlabelled hypoxanthine in complex with the pbuE adenine riboswitch aptamer and the xpt guanine riboswitch aptamer are discussed. These spectra showed a pattern of multiple IR bands that appeared to be characteristic for the respective complex.
Photoinduzierte Energietransferprozesse und -reaktionen spielen in vielen Gebieten von Chemie, Physik und Biologie eine wichtige Rolle. Zu den prominentesten Beispielen zählen der Lichtsammelprozess in der Photosynthese und der Anregungsenergietransfer in funktionellen Materialien. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf letzterem Bereich, genauer auf organischer Elektronik und flexiblen Donor-Akzeptor-Bausteinen und Schaltern. Im Besonderen werden hier zwei verschiedene Typen von funktionellen organischen Systemen betrachtet: zum einen oligomere Fragmente organischer halbleitender Polymere wie Oligo-p-Phenylen-Vinylen (OPV) und Oligo-Thiophen (OT), welche als Bausteine für neuartige organische Solarzellen dienen, und zum anderen kleine funktionelle Donor-Akzeptor-Einheiten wie Dithienylethen-Bordipyrromethen (DTE-BODIPY). Letzteres wurde in Kooperation mit den experimentellen Gruppen von K. Rück-Braun (TU Berlin) und J. Wachtveitl (Goethe Universität) untersucht. Um die relevanten Energietransfermechanismen genauer zu verstehen, wurden an diesen Systemen elektronische Strukturrechnungen und quantendynamische Untersuchungen durchgeführt. Hierzu wurden mittels ab initio-Methoden Modell-Hamiltonians parametrisiert und mit hochdimensionalen quantendynamischen oder semiklassischen Methoden kombiniert. Während die Parametrisierung für kleinere Fragmente durchgeführt wurde, lässt sich der so parametrisierte Hamiltonian ohne Weiteres auf größere Systeme erweitern. Die dynamischen Studien der betreffenden Systeme wurden mittels der Multikonfigurationellen Zeitabhängigen Hartree (MCTDH) Methode durchgeführt, welche eine vollständige quantendynamische Beschreibung des Systems zulässt. Für größere Systeme wurde die semiklassische Ehrenfest Methode in Verbindung mit dem Langevin-Ansatz zur Beschreibung von Umgebungseffekten genutzt. Hierzu wurde ein eigens für diese Methode und Systeme geschriebenes Programm eingesetzt. Im Falle der OT- und OPV-Oligomere wurde die Dynamik bei Vorliegen eines strukturellen Defekts untersucht. Ziel war es hierbei, die dynamischen Phänomene, welche durch die Photoanregung induziert werden, zu untersuchen. Des Weiteren wurde untersucht, ob das Konzept von „spektroskopischen Einheiten“, welche die Lokalisierung der Anregung durch strukturelle Defekte beschreibt, in diesen Systemen zutrifft. Hierzu wurden die Systeme in einer Frenkel-Basis definiert, welche ein auf einem Monomer lokalisiertes Elektron-Loch-Paar beschreibt. Delokalisierte elektronische Anregungen können somit als Superposition solcher Frenkel-Zustände beschrieben werden. Neben der Frenkel-Basis wurde aber auch eine verallgemeinerte Elektron-Loch-Basis verwendet, welche über zusätzliche Ladungstransferzustände eine räumliche Separation von Elektronen und Löchern erlaubt.Die Parametrisierung des OPV- und OT-Hamiltonians erfolgte mittels der Algebraischen Diagrammatischen Konstruktions (ADC(2))-Methode, welche in Kombination mit einer Übergangs-Dichte-Matrix-Analyse eine sehr akkurate Beschreibung der Frenkel- und Ladungstransferzustände basierend auf den supermolekularen Zuständen erlaubt. Um vibronische Effekte auf die Dynamik miteinzubeziehen,wurden nieder- und hochfrequente Torsions- und alternierende Bindungslängenmoden des Systems im Hamiltonian berücksichtigt. Hierzu wurden eindimensionale Schnitte der Potentialflächen entlang dieser Koordinaten berechnet und mittels einer Transformation in diabatische Potentialflächen überführt. Mit diesem Setup wurden die quantendynamischen und semiklassischen Simulationen für ein OPV/OT-Hexamer und ein 20-mer durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Simulationen zeigen, dass der Energietransfer auf einer Subpikosekunden-Zeitskala stattfindet und eine starke Abhängigkeit vom Vorliegen eines strukturellen Defekts aufweist. Des Weiteren konnte auf einer Zeitskala von 100 Femtosekunden eine Lokalisierung des Exzitons beobachtet werden. Fluktuationseffekte werden zudem über Quantenfluktuationen im Falle von MCTDH bzw. über thermische Fluktuationen im Falle des Ehrenfest-/Langevin-Ansatzes berücksichtigt. Letzterer ist jedoch nicht in der Lage, die kohärente Charakteristik der mit den Schwingungsmoden gekoppelten Exziton- und Lokalisierungsdynamik wiederzugeben. Dagegen kann dieser Ansatz erfolgreich genutzt werden, um eine fluktuationsgetriebene „Hopping“-Dynamik des quasi- stationären Zustandes auf einer längeren Zeitskala in Abhängigkeit von der Temperatur zu beschreiben. Die Beschreibung der Photodynamik der DTE-BODIPY-Dyade zielt darauf ab, experimentell beobachtete vibrationelle Schwingungen des BODIPY-Fragments zu erklären, die ohne eine direkte Anregung dieses Fragments zustande kommen. Diese wurden nach einer selektiven Anregung des DTE-Fragments in zeitaufgelösten UV/Vis Anreg-Abtast-Experimenten beobachtet. Der Fokus der Untersuchung liegt daher auf der Beschreibung der photoinduzierten intramolekulare Energieumverteilung (IVR) auf einer Subpikosekunden-Zeitskala. Die DTE-BODIPY Dyade wurde mittels eines Hamiltonians, welcher durch TDDFT Rechnungen parametrisiert wurde, dargestellt. Basierend auf den Normalmoden des Systems, wurden lokale DTE- und BODIPY-Moden konstruiert, wobei einige dieser Moden miteinander gekoppelt sind und die Photoanregung des DTE auf das BODIPY-Fragment übertragen. Hierbei zeigte sich, dass die Zeitskala und die charakteristischen Frequenzen des Experiments mittels der hochdimensionalen MCTDH-Methode gut reproduziert wurden. Aus den Simulationen ergab sich zudem, dass der beobachtete Energietransfer stark von einem Reservoir von vibrationell angeregten lokalen DTE-Moden beeinflusst wird. Der untersuchte IVR- Prozess zeigt zudem eine ausgeprägte Abhängigkeit von lokalen Kopplungen und der Kopplung an eine Umgebung.