TY  - THES
A1  - Jess, Urda
T1  - Untersuchungen zur Interaktion zytoplasmatischer Proteine mit dem Serotonintransporter
N2  - Untersuchungen zur Interaktion zytoplasmatischer Proteine mit dem Serotonintransporter Der plasmamembranständige Serotonintransporter SERT terminiert die Neurotransmission an serotonergen Synapsen durch den schnellen Rücktransport des Neurotransmitters Serotonin (5­HT) in die Präsynapse. Neben seinem präsynaptischen Vorkommen wird der SERT auch axonal in Varikositäten immundetektiert. Der Substrattransport selbst unterliegt der Kontrolle des Ca 2 /CaM­, des Stickoxid (NO)­ und des Proteinkinase C (PKC)­ Signaltransduktionsweges. Letzterer bestimmt die Oberflächenverfügbarkeit des SERT durch dessen Sequestrierung. Die Regulation der Lokalisation und des Substrattransports des SERT sollte durch assoziierte Proteine erzielt werden. Da bislang jedoch keine interagierenden Proteine des SERT bekannt waren, sollten in dieser Arbeit mit Hilfe des Hefe­Zwei­Hybrid­Systems zytoplasmatische Interaktionspartner des SERT identifiziert werden. Erste Untersuchungen an heterolog exprimierten Deletionsmutanten der Termini des SERT ergaben, daß diese zytoplasmatischen Domänen für die Funktion des Proteins unabdingbar sind. Im folgenden wurde daher mit dem Carboxyterminus des SERT eine hirnspezifische cDNA­Bibliothek der neugeborenen Ratte durchsucht. Es wurden vier cDNA­Klone isoliert, die für putative Interaktionspartner des SERT kodierten. Die Relevanz dieser genetisch nachgewiesenen Interaktionen wurde biochemisch mittels affinitätschromatographischer Studien untersucht, während immunzytochemische Analysen die Interaktionen durch die Umverteilung oder durch die Colokalisation der coexprimierten Proteine in vivo validierte. Pharmakologische Untersuchungen sollten darüberhinaus Aufschluß über den regulatorischen Einfluß der Interaktion auf die Transportfunktion des SERT geben. Nach diesen Aspekten wurden zwei der putativen Interaktionspartner näher untersucht. Der erste untersuchte cDNA­Klon kodierte für die ß­Untereinheit der intrazellulären Acetylhydrolase des "platelet­activating factor" (ßPAF­AH). Affinitätschromatographisch wurde die Interaktion durch die Präzipitation der eukaryotisch überexprimierten ß­ Untereinheit an einem bakteriell exprimierten Fusionsprotein des SERT­CT bestätigt. Die immunzytochemische Analyse zeigte nach der Coexpression der ß­PAF­AH und dem SERT eine Umlokalisierung des zytoplasmatischen Proteins an Bereiche plasmamembranständiger SERT­Immunreaktivität. Durch Wiederaufnahmestudien wurde kein Effekt der ßPAF­AH auf die Transportfunktion des SERT ermittelt, weshalb die funktionelle Bedeutung dieser Interaktion vorerst unklar bleibt. Der zweite Klon kodierte für das Ratten­spezifische Homolog des myristoylierten Alanin­ reichen Proteinkinase C­Substrats (MacMARCKS). Der biochemische Nachweis einer Interaktion konnte hier nicht erbracht werden. Dagegen zeigte die immunzytochemische Analyse eine Colokalisation von MacMARCKS und SERT in diskreten Bereichen der Plasmamembran. Hinweise auf die physiologische Bedeutung konnten durch die pharmakologische Analyse gewonnen werden. So induzierte die Coexpression von MacMARCKS und SERT eine Abnahme der maximalen Transportrate (Vmax) um 29,6 ± 18,6 % (n = 3) im Vergleich zu GFP­exprimierenden Kontrollzellen. Die Stimulierung der PKC erzielte dagegen kaum eine weitere Reduktion der Vmax im Gegensatz zu den Kontrollzellen, während die Behandlung der Zellen mit einem PKC­Inhibitor zum Angleich der Vmax der Konrollzellen und der MacMARCKS­exprimierenden Zellen führte. Daraus wurde gefolgert, daß MacMARCKS an der Regulation der Transportfunktion des SERT durch dessen Sequestrierung beteiligt ist. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit zwei Interaktionspartner des SERT­CT identifiziert, deren mögliche Funktionen in der Regulation der intrazellulären 5­HT­ Konzentration einerseits bzw. der Regulation der Transportfunktion des SERT andererseits liegen könnten.
Y1  - 2000
UR  - http://publikationen.ub.uni-frankfurt.de/frontdoor/index/index/docId/5551
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hebis:30-0000001573
ER  -