TY  - THES
A1  - Horn, Carsten
T1  - Biophysikalische und strukturbiologische Charakterisierung des ABC-Transporters OpuA aus Bacillus subtilis
N2  - Die Familie der ubiquitären ATP binding cassette (ABC)-Membranproteine katalysiert unter Hydrolyse von ATP die Translokation von Substraten über biologische Membranen. In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Struktur und Funktion des osmoprotectant uptake (Opu) Systems A aus B. subtilis untersucht, das aus drei Untereinheiten, der ATPase OpuAA, dem integralen Membranprotein OpuAB und dem Substrat-Bindeprotein OpuAC, besteht und unter hyperosmolaren Bedingungen die kompatiblen Solute Glycin-Betain (GB) und Prolin-Betain (PB) in die Zelle importiert, um eine Plasmolyse zu verhindern. Sämtliche Untereinheiten wurden getrennt oder als OpuAA/AB Komplex in E. coli überproduziert und bis zur Homogenität isoliert. OpuAA zeigte ein dynamisches Monomer-Dimer Gleichgewicht (KD= 6 µM), das durch Nukleotide beeinflusst wurde. Unter Bedingungen hoher Ionenstärke konnten Monomer und Dimer getrennt isoliert und analysiert werden. Die Affinitäten und Stöchiometrien der OpuAA/Nukleotid Komplexe wurden unter Verwendung des fluoreszierenden TNP-ATP bzw. einer Nukleotid-sensitiven Trp-Mutante des OpuAA untersucht. Das Monomer hatte ein Molekül TNP-ATP gebunden, während zwei Moleküle TNP-ATP in dimerem OpuAA detektiert wurden. Die Affinität von Nukleotiden zu OpuAA nahm in folgender Reihe zu: ATP<ATP/Mg2+<ADP/Mg2+. Eine Erhöhung der Ionenstärke bewirkte nicht nur eine Erniedrigung der KD-Werte von OpuAA/Nukleotid Komplexen, sondern auch eine Steigerung der ATPase Aktivität. In 1 M NaCl zeigte das Monomer basale ATPase Aktivität, während das Dimer nur sehr geringe Aktivität hatte, jedoch durch Zugabe von OpuAB und OpuAC aktiviert wurde. K+ wurde als ein Modulator der ATPase Aktivität von OpuAA identifiziert. Die Zugabe von TNP-ADP/Mg2+ induzierte in dimeren OpuAA einen konformellen Wechsel, der zu einem Zerfall des Dimers führte. Monomer und Dimer hatten gegenüber Nukleotiden unterschiedliche Affinitäten, was eine unterschiedliche Architektur der Nukleotid-Bindetasche implizierte. Die Architektur des OpuAA Dimers wurde mittels FRET untersucht. Dazu wurde OpuAA ortspezifisch mit Fluorophoren markiert und ein Verfahren etabliert, in dem die intermolekularen Distanzen des Dimers bestimmt werden konnten. Ein Vergleich der Distanzen mit anderen NBD Dimeren zeigte, dass OpuAA eine zu BtuD oder MalKE. coli vergleichbare Dimer Architektur mit einer head-to-tail Orientierung hat. Die Struktur des OpuAC/GB und OpuAC/PB Komplexes wurde durch Röntgenstrukturanalyse mit einer Auflösung von 2,7 Å bzw. 2,8 Å aufgeklärt und zeigte zwei globuläre Domänen, die über zwei Peptidsegmente miteinander verbunden waren. Die delokalisierte positive Ladung des Liganden war von einem cluster aus drei Trp-Resten, dem sog. "Tryptophan-Prisma", über kationische-p-Interaktion komplexiert. Nach Ligandenbindung wurden beide Domänen durch eine Wasserstoffbrücke zwischen den konservierten Asp22 und Trp178 überbrückt. Dieser molekulare Schalter wurde von OpuAC genutzt, um Affinitäten von GB und PB zu regulieren.
N2  - The family of the ubiquitous ATP binding cassette (ABC) membrane proteins catalyzes the translocation of substrates across biological membranes under the hydrolysis of ATP. In the present work the structure and function of the osmoprotectant uptake (Opu) system A from B. subtilis was investigated. OpuA is composed of three subunits: the ATPase OpuAA, the integral membrane protein OpuAB and the extracellular substrate-binding protein OpuAC. Under hyperosmotic growth conditions OpuA imports the compatible solutes glycine betaine (GB) and proline betaine (PB) into the cell to prevent plasmolysis. All three subunits were overproduced in E. coli as separate proteins or as OpuAA/AB complex and purified to homogeneity. OpuAA revealed a dynamic monomer-dimer equilibrium (KD= 6 µM) that was influenced by nucleotides indicating a coupling between oligomeric and functional state. Under conditions of high ionic strength both monomer and dimer could be isolated and analyzed separately. The affinities and stoichiometries of OpuAA/nucleotide complexes were determined by means of the fluorescent TNP-ATP or a nucleotide-sensitive Trp-mutant of OpuAA. The monomer bound one molecule TNP-ATP while two molecules TNP-ATP were associated with the dimer. The affinity of nucleotides to OpuAA increased in the following order: ATP<ATP/Mg2+<ADP/Mg2+. Increased ionic strength decreased the KD values of OpuAA/nucleotide complexes and increased ATPase activity. In the presence of 1 M NaCl, monomeric OpuAA showed a basal ATPase activity, whereas the dimer showed little ATPase activity that could however be stimulated by OpuAB and OpuAC. K+ was identified as a modulator of the ATPase activity. The addition of TNP-ADP/Mg2+ induced a conformational change in dimeric OpuAA that led to a decay of the dimer. Monomer and dimer had different affinities for nucleotides suggesting a different architecture of the nucleotide-binding pocket. The architecture of the OpuAA dimer was investigated by FRET. For that purpose, the catalytic or regulatory domain of OpuAA was labeled with fluorophores and a method was established to determine intermolecular distances. A comparison with distances of related dimeric ATPases indicated that OpuAA assembled with a dimer-interface similar to BtuCD or MalKE. coli in a head-to-tail orientation. The structure of OpuAC/GB and OpuAC/PB was solved by X-ray crystallography at a resolution of 2.7 Å and 2.8 Å, respectively. The complex showed two globular domains that were connected by two peptide segments and the ligand was localized in a cleft between the two domains. The delocalized positive charge of the ligand was coordinated by cationic-p-interactions in a cluster of three Trp residues, the so-called "tryptophane-prism". After ligand binding both domains were bridged by a hydrogen bond between the conserved Asp22 and Trp178. This molecular switch was used by OpuAC to regulate affinities of GB and PB, respectively.
Y1  - 2004
UR  - http://publikationen.ub.uni-frankfurt.de/frontdoor/index/index/docId/5133
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hebis:30-0000004675
ER  -