TY  - THES
A1  - Olkhova, Elena
T1  - Molecular dynamics simulations and hydrogen-bonded network dynamics of cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans
N2  - Cytochrome c oxidase is the terminal enzyme in the respiratory chain of mitochondria and aerobic bacteria. This enzyme ultimately couples electron transfer from cytochrome c to an oxygen molecule with proton translocation across the inner mitochondrial and bacterial membrane. This reaction requires complicated chemical processes to occur at the catalytic site of the enzyme in coordination with proton translocation, the exact mechanism of which is not known at present. The mechanisms underlying oxygen activation, electron transfer and coupling of electron transfer to proton translocation are the main questions in the field of bioenergetics. The major goal of this work was to investigate the coupling of electron transfer and proton translocation in cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans. Different theoretical approaches have been used to investigate the coupling of electron and proton transfer. This thesis presents an internal water prediction scheme in the enzyme and a molecular dynamics study of cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans in the fully oxidized state, embedded in a fully hydrated dimyristoylphosphatidylcholine lipid bilayer membrane. Two parallel molecular dynamics simulations with different levels of protein hydration, 1.125 ns each in length, were carried out under conditions of constant temperature and pressure using three-dimensional periodic boundary conditions and full electrostatics to investigate the distribution and dynamics of water molecules and their corresponding hydrogen-bonded networks inside cytochrome c oxidase. The average number of solvent sites in the proton conducting K- and D- pathways was determined. The highly fluctuating hydrogen-bonded networks, combined with the significant diffusion of individual water molecules provide a basis for the transfer of protons in cytochrome c oxidase, therefore leading to a better understanding of the mechanism of proton pumping. The importance of the hydrogen bonding network and the possible coupling of local structural changes to larger scale changes in the cytochrome c oxidase during the catalytic cycle have been shown.
N2  - Cytochrom-c-Oxidase (COX) ist das terminale Enzym der Atmungskette von Mitochondrien und aeroben Bakterien. Dieses Enzym katalysiert den Elektronentransfer von Cytochrom c auf molekularen Sauerstoff und die Translokation von Protonen über die innere Mitochondrien- bzw. Bakterienmembran. Der genaue Ablauf dieses Prozesses ist bis jetzt noch nicht verstanden. Die Bioenergetik beschäftigt sich hauptsächlich mit den Mechanismen, die der Sauerstoffaktivierung, dem Elektronentransfer und der Protonenverschiebung zugrunde liegen. Die Cytochrom-c-Oxidase, die in die innere Membran der Mitochondrien und vieler Bakterien integriert ist, ist eines der am intensivsten untersuchten Membranproteine. Sie katalysiert den terminalen Schritt der Zellatmung, den Transfer von vier Elektronen von Cytochrom c zum Sauerstoffmolekül (Babcock, G. T., M. Wikström. 1992. Oxygen activation and the conservation of energy in cell respiration. Nature 356(6367):301-309). Die Reduktion des Sauerstoffmoleküls zu Wasser ist mit einer Verschiebung ("Pumpen") von vier Protonen über die innere Mitochondrienmembran, bzw. bakterielle Cytoplasmamembran verbunden (Wikström, M. K. F. 1977. Proton pump coupled to cytochrome c oxidase in mitochondria. Nature 266:271-273). Der daraus entstehende Protonengradient, deltaµH+, kann von der ATP-Synthase zur Erzeugung von ATP genutzt werden (Abbildung 1). Die O2-Reduktion findet in einem binuklearen Häm-a3/CuB-Zentrum statt. Diese Reaktion hat eine sehr hohe Aktivierungsenergie; sie läuft nicht spontan ab. Die Erzeugung von Sauerstoff ist stark exergon; eine große Energiemenge wird während dieses Prozesses frei. Die Cytochrom-c-Oxidase hat die Aufgabe, das Sauerstoffmolekül zu aktivieren und die Energie aufzufangen, die während dieser Reaktion anfällt. Die Energie wird in Gestalt eines elektrochemischen Protonengradienten über die Membran gespeichert, deltaµH+. Die Cytochrom-c-Oxidase ermöglicht den Aufbau eines Protonengradienten nach zwei Prinzipien: Vektorielle Chemie und Protonenpumpen. Das erste Prinzip ist eine direkte Konsequenz von orientierter Chemie im Inneren des Proteins. Nativ sitzt das Enzym in der Lipidmembran von Mitochondrien und prokaryontischen Zellen, wobei die Elektronen in das Enzym vom Cytochrom c aus von einer Membranseite gelangen, während die Protonen, die zur Wassererzeugung erforderlich sind, von der anderen Membranseite kommen. Der Transport von vier Ladungen durch die Lipidmembran geschieht allein durch chemische Prozesse. Die atomaren Strukturen der Cytochrom-c-Oxidase von Paracoccus denitrificans Mitochondrien aus Rinderherz, Thermus thermophilus und Rhodobacter sphaeroides wurde mittels Röntgenkristallographie bestimmt (Abbildung 3). Die Untereinheit II enthält ein ein bimetallisches CuA-Zentrum, und Untereinheit I enthält zwei redox-aktive Cofaktoren: eine Häm a mit niedrigem Spin und ein binukleares Metallzentrum, das durch das Häm a3 und CuB gebildet wird. Beide Häme liegen im Inneren des Transmembranteils des Enzyms; der Abstand zwischen den beiden Eisenatomen beträgt etwa 13 Å, wobei beide etwa 20 Å vom Periplasma entfernt liegen und 35 Å vom Cytoplasma. Diese relativ kompakte Gruppierung von Metallzentren in der Untereinheit I liegt nahe an der cytoplasmatischen Oberfläche, wobei es durch einen Protonenkanal mit der negativen wässrigen Phase verbunden ist, so dass entsprechende Protonenreaktionen in Einklang mit den Elektronentransportprozessen ablaufen können. Elektronen vom Cytochrom c werden auf das CuA-Zentrum übertragen und dann über Häm a weiter in das binukleare Zentrum (Michel, H. 1998. The mechanism of proton pumping by cytochrome c oxidase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12819-12824; Mills, D. A., and S. Ferguson-Miller. 2003. Understanding the mechanism of proton movement linked to oxygen reduction in cytochrome c oxidase: lessons from other proteins. FEBS Letters 545:47-51). Im binuklearen Zentrum wird Sauerstoff an das Häm-a3-Eisen gebunden, dann reduziert, wobei letztlich zwei Wassermoleküle entstehen. Es existieren zwei zusätzliche, nicht redox-aktive Metallzentren in der Cytochrom-c-Oxidase von Paracoccus denitrificans: ein Mg/Mn-Bindungszentrum an der Grenzfläche zwischen den Untereinheiten I und II und eine Ca-Bindungsstelle. Die Ergebnisse von ortsgerichteter Mutagenese (Thomas, J. W., A. Puustinen, J. O. Alben, R. B. Gennis, and M. Wikström. 1993. Substitution of asparagine for aspartate-135 in subunit I of the cytochrome bo ubiquinol oxidase of Escherichia coli eliminates proton-pumping activity. Biochemistry 32:10923-10928; Brzezinski, P., P. Adelroth. 1998. Proton-controlled electron transfer in cytochrome c oxidase: functional role of the pathways through Glu 286 and Lys 362. Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:7-16; Mills, D. A., and S. Ferguson-Miller. 1998. Proton uptake and release in cytochrome c oxidase: separate pathways in time and space? Biochim. Biophys. Acta 1365(1-2):46-52; Aagaard, A., G. Gilderson, D. A. Mills, S. Ferguson-Miller, P. Brzezinski. 2000. Redesign of the proton-pumping machinery of cytochrome c oxidase: proton pumping does not require Glu(I-286). Biochemistry 39(51):15847-15850; Pfitzner, U., K. Hoffmeier, A. Harrenga, A. Kannt, H. Michel, E. Bamberg, O. M. Richter, B. Ludwig. 2000. Tracing the D-pathway in reconstituted site-directed mutants of cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans. Biochemistry 39(23):6756-62) und die Analyse der Strukturdaten (Iwata, S., C. Ostermeier, B. Ludwig, H. Michel. 1995. Structure at 2.8 Å resolution of cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans. Nature 376:660-669) deuten auf die Existenz zweier verschiedener Protonenwege hin (Abbildung 2). Der K-Weg für den Protonentransfer führt zum aktiven Zentrum über den essentiellen Lysinrest Lys354, während der nach Asp124 benannte D-Weg vom Asp124 über einen lösungsmittelgefüllten Hohlraum nach Glu278 führt. Der Protonenweg jenseits von Glu278 ist bisher unklar. Er könnte über eine temporär gebildete Wasserkette direkt in das binukleare Zentrum führen oder alternativ zum Häm-a3-Propionat, entweder durch direkte Kontakte aufgrund von Konformationsänderungen zu Glu278 oder durch in der Electronendichtekarte nicht sichtbare Wassermoleküle (Michel, H. 1998. The mechanism of proton pumping by cytochrome c oxidase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12819-12824). Es wurde vorgeschlagen, dass diese beiden Protonenpfade mit verschiedenen Teilen des katalytischen Zyklus funktional assoziiert sein könnten. Trotz aller Strukturkenntnisse, bleibt der Mechanismus der Kopplung zwischen Redoxprozess und Protonenpumpen weiterhin weitgehend unbekannt. Ziel dieser Dissertation war die Untersuchung der Kopplung von Elektronenübertragung und Protonentransport in der Cytochrom-c-Oxidase von Paracoccus denitrificans mittels elektrostatischer und molekulardynamischer Berechnungen. Diese Dissertation beschreibt Modellrechnungen an der Cytochrome-c-Oxidase von Paracoccus denitrificans. Die gemeinsame Verwendung der hier vorgestellten unterschiedlichen Methoden führte zu überzeugenden Ergebnissen, die ein besseres Verständnis von Experimenten erlauben könnten, und bieten Einsicht in den Mechanismus des Protonentransports in solch komplexen Systemen. Die Ergebnisse dieser theoretischen Arbeit können auch dazu dienen zu verstehen, welche einfachen theoretischen Ansätze fruchtbar sind und welche nicht, und führen zur Entwicklung einiger neuer und genauerer Modelle. Zunächst wurden in dieser Arbeit die Positionen der Wassermoleküle im Enzym vorhergesagt und ein Modell erstellt. Dann wurden molekulardynamische Simulationen an dem System durchgeführt, in welchem die Cytochrom-c-Oxidase im vollständig oxidierten Zustand in eine komplett hydratisierte Dimyristoylphosphadidylcholin-Lipid-Doppelschicht eingebettet ist. Aus der Kombination dieser beiden Ansätze wurde ein dynamisches Modell entwickelt, mit dem sich die Wasserstoffbrücken im Inneren der Cytochrom-c-Oxidase beschreiben lassen. Dazu wurden parallel zwei molekulardynamische Modellrechnungen jeweils für die Dauer von 1,125 ns bei konstantem Druck und konstanter Temperatur durchgeführt. Dabei wurde der unterschiedliche Grad der Hydratisierung des Proteins unter dreidimensional periodischen Randbedingungen bei vollständiger Berücksichtigung der elektrostatischen Wechselwirkung mit einbezogen. Aus diesem Modell konnte die mittlere Anzahl der Wassermoleküle in den für die Protonenleitung wichtigen des K- und des D-Wegen berechnet werden. Die beobachteten leicht veränderlichen Wasserstoffbrückennetzwerke schaffen zusammen mit der deutlichen Diffusion von einzelnen Wassermolekülen eine Grundlage, den Protonentransport in der Cytochrom-c-Oxidase und den Vorgang des Protonenpumpens besser zu verstehen. Es konnte einerseits die Bedeutung des Wasserstoffbrückennetzwerkes belegt und andererseits eine mögliche Verknüpfung von lokalen Strukturänderungen mit Konformationsänderungen in übergeordneten Bereichen der Cytochrom-c-Oxidase während des katalytischen Zyklusses gezeigt werden. Durch Röntgenstrukturanalyse ermittelte Proteinstrukturen können das Protonierungs- / Deprotonierungsgleichgewicht nur in einem begrenzten pH-Intervall zutreffend beschreiben. Das in dieser Arbeit berechnete Modell hingegen ist in der Lage, den Einfluss von pH-Änderungen auf einzelne Aminosäuren zu simulieren und die Auswirkung auf das ganze System zu ermitteln . Am Beispiel der Aminosäure Lys-II-191 konnte gezeigt werden, das durch die Änderung der Orientierung der Seitenkette einer einzigen Aminosäure sich der Protonierungszustand des gesamten Proteins dramatisch ändert. Da das Vorkommen interner Wassermoleküle sowie lokale und großräumige Änderungen der Konformation von Aminosäuren mit Redox-Änderungen gekoppelt sein könnte, wurde eine Anzahl molekulardynamischer Modellrechnungen (Kapitel 4 & 5) und Berechnungen zu möglichen Positionen interner Wassermoleküle (Kapitel 2) durchgeführt. Die Rechnungen lieferten eine weit größere mittlere Anzahl von internen Wassermolekülen als in den Strukturbestimmungen gefunden wurde. Unser System umfasst 100 000 Atome und ist damit viel grösser als typische Simulationen von Membranproteinen, wie Bacteriorhodopsin oder der KcsA- Kanal. Im Folgenden wird beschrieben, wie für die Cytochrome-c-Oxidase durch Konstruktion einer DMPC (Dimyristoylphosphadidylcholin) Doppellipidschicht eine geeignete Membranumgebung geschaffen wurde. Wir benutzten ein allgemeines Protokoll für molekulardynamische Simulationen um die Ausgangskonfiguration des Protein-Membran-Wasser Systems zu konstruieren. Das mikroskopische System besteht aus der Cytochrom-c-Oxidase (2 Untereinheiten, bestehend aus je 549 und 254 Aminosäuren, 181 Lipiden, 88 internen Wassermolekülen, die in der Kristallstruktur der Oxidase nachgewiesen werden konnten und eingefügt, um eine 100 mM Salzlösung zu simulieren. (Die Ionen wurden nicht weiter als bis auf 6Å an die Lipiddoppelschicht angenähert. Eine Bildung von Ionenepaaren wurde nicht erlaubt). Nach Solvatisierung bestand das System aus insgesamt 101852 Bzw. 103589 Atomen. Die hier vorgestellten Molekulardynamiksimulation führen zu einem stabilen System. Die Molekulardynamik Rechnungen erreichten nach etwa 1 ns ein dynamisches Gleichgewicht wegen der Protein - Membran-, als auch der Protein - Wasser-Wechselwirkungen. Ähnliches Verhalten wurde auch von anderen Systemen berichtet (Berneche, S., M. Nina, and B. Roux. 1998. Molecular dynamics simulation of melittin in a dimyristoylphosphatidylcholine bilayer membrane. Biophys. J. 75:1603-1618). Das Netzwerk der Wasserstoffbrücken in der Cytochrom-c-Oxidase ist nicht gleichmäßig verteilt und die Anordnung der Wassermoleküle ist veränderlich. Das Protein - Membran - Wasser-Modell erlaubt eine genaue Beschreibung der Struktur und der Beweglichkeit der Wasserstoffbrücken, so dass eine Anzahl permanenter Positionen für Wassermoleküle in den K- und D-Wegen erkannt wurden. Das Netzwerk der Wasserstoffbrücken konnte in viele Richtungen bis oberhalb von Häm a und Häm a3 beobachtet werden. In einigen Positionen in Ionen wurden 24323 Wassermolekülen in der Umgebung der Cytichrom-c-Oxidase (Olkhova, E., M. C. Hutter, M. A. Lill, V. Helms, and H. Michel. Dynamic water networks in cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans investigated by molecular dynamics simulations. Biophys J., accepted). Zusätzlich wurden 176 bzw. 755 Wassermoleküle, die mit Hilfe der GRID Methode konstruiert wurden, in das System integriert. 42 Na+ und 30 Cl-der Nähe des binuclearen Zentrums haben Wassermoleküle Lebensdauern von etwa 1 ns, im Allgemeinen aber sind die Wassermoleküle viel mobiler. Die Ergebnisse zeigen bewegliche Wassermoleküle auch in Bereichen in denen mit kristallographischen Methoden kein Wasser gefunden wurde. Eine Erklärung des großen Unterschieds in der Anzahl der internen Wassermoleküle zwischen den Modellrechnungen und den kristallographischen Strukturbestimmungen liegt in deren hohen Beweglichkeit und Austauschrate zwischen inneren und äußeren Positionen. Während die Ergebnisse unserer Modellrechnungen mit früheren theoretischen Untersuchungen im Allgemeinen übereinstimmen (Hofacker, I., and K. Schulten. 1998. Oxygen and proton pathways in cytochrome c oxidase. Proteins 30(1):100-107; Riistama, S., G. Hummer, A. Puustinen, R. B. Dyer, W. H. Woodruff, M. Wikström. 1997. Bound water in the protein translocation mechanism of the heme-copper oxidases. FEBS Letters 414:275-280; Zheng, X., D. M. Medvedev, J. Swanson, A. A. Stuchebrukhov. 2003. Computer simulation of water in cytochrome c oxidase. Biochim. Biophys. Acta 1557:99-107; Wikström, M., M. I. Verkhovsky, G. Hummer. 2003. Water-gated mechanism of proton translocation by cytochrome c oxidase. Biochim. Biophys. Acta 1604(2):61-5), gibt es doch einige Unterschiede. Der wesentliche betrifft die deutliche Diffusion der einzelnen Wassermoleküle in den D- und K- Wegen, wie auch in dem Bereich, der sie mit dem binuclearen Zentrum verbindet. Die Art des Protonentransports entlang dieser Wege könnte sich von der Art unterscheiden, wie sie über Wasserketten in Gramicidin A und Nanoröhrchen beschrieben wurde. Wir hatten anfangs erwartet, eine kleine Anzahl definierter Netze von Wasserstoffbrücken zu finden, wie beispielsweise für Vitamin B12 beschrieben (Savage, H. 1986. Water structure in vitamin B12 coenzyme crystals. I. Analysis of the neutron and x-ray solvent densities. Biophys. J. 50(5):947-956). Jedoch stellte sich heraus, dass in Cytochrome-c-Oxidase das System der Wasserstoffbrücken so beweglich und komplex ist, dass es nur mit Abbildungen und Tabellen nicht hinreichend genau zu beschreiben ist. Jeder Pfad entlang Wasserstoffbrücken ist kurzlebig. Protontransport findet eher durch viele wechselnde und unterschiedliche Pfade statt, die sich aus der Umorientierung und dem Austausch von Wassermolekülen ergeben, als über einen einzigen Pfad von Wasserstoffbrücken. Dennoch muss ein Triebkraft für den Protonentransport in eine bestimmte Richtung gegeben sein. Die MD Modellrechnungen liefern erste Einsichten wie während des katalytischen Zyklus lokale Änderungen in den aktiven Stellen von Cytochrom-c-Oxidase mit Konformationsänderungen des ganzen Proteins verknüpft sind, insbesondere des Netzwerks der Wasserstoffbrücken.
Y1  - 2003
UR  - http://publikationen.ub.uni-frankfurt.de/frontdoor/index/index/docId/5188
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hebis:30-0000004153
CY  - Frankfurt am Main
ER  -