TY  - THES
A1  - Yang, Ji Yeon
T1  - Identification and characterization of apoptosis-associated genes in hematopoietic cells using gene trapping and microarray technologies
N2  - A gene trap strategy was used to identify genes induced in hematopoietic cells undergoing apoptosis by growth factor withdrawal. IL-3 dependent survival of hematopoietic cells relies on a delicate balance between proliferation and apoptosis that is controlled by the availability of cytokines (Thompson, 1995; Iijima et al., 2002). From our previous results of gene trap assay, we postulated that transcriptionally activated antagonistic genes against apoptosis might actually block or delay cell death (Wempe et al., 2001) causing cells to have carcinogenic behavior. The analysis attempted to better understand the outcome of a death program following IL-3 deprivation and to identify those survival genes whose expression is affected by time dependent manner. As described in the chapter 4, there would be two major conclusions evident from the three separate experiments (Genetrap, Atlas cDNA array and Affymetrix chips): Firstly 56% of trapped genes, that are up-regulated by IL-3 withdrawal (28 of 50), are directly related to cell death or survival. Secondly, unlike most array technologies, gene trapping only selects for the transiently induced genes that is independent of pre-existing steady state mRNA levels. In regarding correlations of the genes with potential carcinogenesis, the pre-existing mRNA makes difficult to describe the unique characteristics of deregulated tumor tissue genes. For a joint project with Schering (Schering AG, Berlin), the genes of our GTSTs were examined. The first screen with custom array was used to look for whether the survival genes of our GTSTs are involved in various cancer cell lines, whilst the second screen with Matched Tumor/Normal Array was used to characterize if the selected seven genes (ERK3, Plekha2, KIAA1140, PI4P5Ka/g, KIAA0740, KIAA1036 and PEST domains) are transformation-related genes or not in different tumor tissues. Twenty-six genes were identified as either induced or repressed in one or more cell lines. Genetic information is expressed in complex and ever changing patterns throughout a life span of cells. A description of these patterns and how they relate to the tissue specific cancer is crucial for our understanding of the network of genetic interactions that underlie the processes of normal development, disease and evolution. The development of cancer and its progression is clearly a multiplex phenotype, as a function of time, involving dozens of primary genes and hundreds of secondary modifier genes. There would be a major conclusion evident from the three separate experiments (Genetrap, Affymetrix mouse chip and Matched Tumor/Normal Array): ERK3 could play a significant role in breast, stomach and uterus carcinogenesis with tissue specific regulations. It is clear that ERK3 is obvious putative survival gene in these tumor tissues. Especially, in breast tumors, seven times up-regulation was considerable and the activation of ERK3 could be a feature of breast tumors. My results imply that the unique deregulation of ERK3 is perhaps the major consequence of possible transformation of normal cells into malignant cancer cells, even though further analysis remains to be determined whether an alterated activity of associated survival genes is primarily responsible for a carcinogenesis. However unlike all the other known MAP Kinases, no stimuli and no nuclear substrates of ERK3 is reported. Therefore, it will be necessary first to determine the spectrum of substrates and to identify the proximal effectors for the ERK3 in breast carcinoma cells.
N2  - Apoptose ist ein zelluläres Suizidprogramm, das in jeder Zelle eines mehrzelligen Lebewesens stattfinden kann. Apoptose ist im Gegensatz zur Nekrose ein physiologischer Prozess, dessen Ziel die Eliminierung von Zellen ist, die vom Gesamtorganismus entweder nicht mehr benötigt werden oder diesem schaden können. Hämatopoetische Zellen sind abhängig von einer Vielzahl verschiedener Zytokine, die deren Überleben und Differenzierung gewährleisten. Entzieht man hämatopoetischen Zellen ihre entsprechenden Wachstumsfaktoren, gehen die Zellen in kurzer Zeit in Apoptose. FDCP1-Zellen sind murine Leukozyten, die myeloische Vorläuferzellen der Monozyten-Granulozyten-Linie darstellen. FDCP-1 Zellen können in Zellkultur mit GM-CSF oder dem pleiopotenten Wachstumsfaktor IL-3 gehalten werden (in unserem Falle IL-3). Nach Entzug von IL-3 folgt eine prä-apoptotische Phase von etwa 8 Stunden, in denen die Apoptose durch Wiederzugabe von IL-3 vollständig rückgängig gemacht werden kann. Bei Wiederzugabe von IL-3 erst nach etwa 12 Stunden sterben fast alle Zellen, was bedeutet, dass in diesen Zellen zwischen Stunde 8 und 12 die unwiederbringliche Entscheidung zur Einleitung der Apoptose gefällt wird. Wie viele andere biologische Prozesse ist die Regulation der Apoptose hierarchisch strukturiert. Die Aktivierung einer exekutiven Ebene (Caspasen, DNasen) führt zur Zerstörung wichtiger Zellfunktionen und zum unwiederbringlichen Zelltod. Über dieser exekutiven Ebene steht eine regulative Ebene (Bcl2-homologe Proteine, regulative Caspasen und weitere Faktoren). Die Proteine der exekutiven Ebene sind meist konstitutiv in den Zellen vorhanden und werden bei einem Überschreiten eines Schwellenwertes auf einer regulativen Ebene nach dem "Schneeballprinzip" aktiviert. Auf regulativer Ebene findet neben posttranslationaler Regulation (Bcl2-homologe Proteine und regulative Caspasen) eine transkriptionelle Aktivierung statt. Diese transkriptionell aktivierten Faktoren (z.B. p53 Kinase oder NF-kB regulierte Gene) können direkt oder indirekt Apoptose positiv oder negativ regulieren. Der zeitlich streng geordnete Ablauf der Apoptose in FDCP1-Zellen sowie die Tatsache, dass bis zu einem bestimmten Zeitpunkt die Zellen durch Wiederzugabe von IL-3 zu retten sind, spricht dafür, dass viele regulative Gene während der Apoptose nur transient aktiviert werden. Bereits vor Beginn der praktischen Arbeit dieser Dissertation wurde in unserem Laboratorium ein Genfallensystem entwickelt, um transkriptionell induzierte regulative Gene während der Apoptose zu identifizieren. Mit Hilfe eines molekularen Schalters, der auch durch kurzfristige Expression der Cre-Rekombinase (hier das Reportergen) von der Expression des "gefloxten" Genes A (TKneo) auf die Expression des Genes B (IL-3) umschaltet, sollten Gene identifiziert worden, die während der Apoptose nach IL-3 Entzug in FDCP1-Zellen transkriptionell induziert werden. Das Prinzip der Genfalle besteht darin, ein promotorloses Reportergen in natürliche Gene einzuführen. Das Reportergen soll bei der Integration ins Zielgenom unter die Kontrolle des natürlichen Promotors gelangen und wie das getroffene natürliche Gen exprimiert werden. Entscheidend für die Nutzbarkeit dieses Systems ist die möglichst unbeeinflusste zufällige Integration ins Genom. Retrovirale Vektoren eignen sich besonders gut als Genfalle, da sie neben der Zufälligkeit des Integrationsortes eine genau definierte Struktur als Provirus im Zielgenom aufweisen. Die Position des Reportergens im Provirus wird so planbar und kann wie in unserem Projekt so gewählt werden, dass der Beginn des Reportergens möglichst weit am 5'- Ende des Provirus liegt. Für 102 "Genetrap specific tags" (GTSTs) konnten Provirus-flankierende DNA-Sequenzen generiert werden. 86 waren lang genug um den Integrationsort im Mausgenom zu bestimmen. von diesen 86 Klonen konnten 73 Virusintegrationen spezifischen Genen zugeordnet werden. Bei den übrigen kann es sich um bisher nicht identifizierter kodierende oder nichtkodierende Gene handeln. Bei der Überprüfung der Virusintegrationen stellte sich heraus, dass bei etwa 50% der Klone die Virusintegration in inverser (antisene) Orientierung zu dem getroffenen Gen vorlag. Es muss in diesen Fällen davon ausgegangen werden, dass die Aktivierung des Cre-Rekombinase Reportergenes durch eine Integration in eine antisense RNA stattgefunden hat. Nach Schätzungen haben vermutlich etwa 8% der Gene antisense RNAs. Die ungewöhnliche Häufung der antisense Integrationen konnte auch in weiteren Projekten mit Cre-Rekombinase als Reportersystem festgestellt werden (andere gebräuchliche Reportergene in Genfallen zeigen diese Eigenschaft nicht). Da bereits eine sehr geringe Konzentration der Cre-Rekombinase reicht aus, um eine Rekombination hervorzurufen, ist zu vermuten, dass auch sehr schwach exprimierte mRNAs mit dem Cre-Reportersystem identifiziert werden können. Zudem könnte das Fehlen einer kodierenden Region in den meisten antisense RNAs dazu führen, dass die Integration zu besonders günstigen Voraussetzungen für den Translationsstart des Cre-Reportergenes führt. Bei der Analyse der Expression der Gene mit antisense Integrationen konnte festgestellt werden, das diese in fast allen Fällen nach IL-3 Entzug herunterreguliert werden, was die Vermutung nahe legt, dass den antisense Transkripten eine regulatorische Rolle zukommt. Von den 50 identifizierten Genen mit wohldefinierter Funktion konnten 28 Genen Überlebens- oder Apoptose-Funktionen zugewiesen werden. Der große Anteil von Genen mit Überlebensfunktionen ist bemerkenswert, da Apoptose die Konsequenz des IL-3-Entzugs ist und eigentlich erwartet wurde, dass hauptsächlich proaopoptotische Gene hochreguliert würden. Da, wie bereits beschrieben, einige der integrierten Gene auch herunterreguliert werden (Integrationen in antisense Orientierung), war unklar ob die jeweilige Regulation pro- oder anti-apoptotische Folgen hat. Bei der Betrachtung der Regulation dieser Genen, fällt auf, dass pro- wie antiapoptotische Gene herunter- wie heraufreguliert werden. Es ergibt sich eine durchaus widersprüchliche, ambivalente Antwort auf den Apoptosestimulus. Wie bereits zuvor gezeigt werden konnte, erzeugt ein zeitlich limitierter IL-3-Entzug in FDCP1-Zellen eine reduzierte nachfolgende Apoptose nach einem weiteren IL-3-Entzug. Die Induktion von Überlebens-Genen so wie Herunterregulation von Apoptose-Genen scheint also in einer zeitlich befristeten ersten Phase nach IL-3-Entzug von großer Bedeutung zu sein. Mit der Absicht, diese Hypothese mit weiteren Genexpressionsmustern zu erweitern, wurde eine Hybridisierung mit Atlas Arrays von Clontech durchgeführt. Bei den Hybridisierungen wurde ein Vergleich der Transkriptmengen der auf dem Filter vorhandenen 588 Gene vor IL-3-Entzug mit den Mengen 4 und 8 Stunden nachher durchgeführt. Für etwa 50% der gebundenen Gene konnte ein Hybridisierungssignal detektiert werden. Nur 12 Gene zeigten signifikante Regulation nach IL-3 Entzug. Bis auf einen Fall konnten die Ergebnisse des Atlas Arrays in Northern Blot Experimenten verifiziert und um weitere Messzeitpunkte erweitert werden. Von den 12 identifizierten Genen konnten 9 Apoptose oder Überlebensfunktionen zugeordnet werden. Die starke Herunterregulation von c-Myc und Pim-1 spiegelte zudem bereits aus der Literatur bekannte Daten wieder. Zusammenfassend stellen die durch den Atlas-Array erhaltenen Daten eine Bestätigung der Hypothese einer ambivalenten Antwort der Zelle auf den Apoptosestimulus dar. Da diese Arbeit Teil einer Kooperation mit der Schering AG (Berlin) war, hatten wir die Möglichkeit, die Genexpression nach IL-3-Entzug in FDCP1-Zellen auch mittels Hybridisierungen mit Affymetrix Chip zu untersuchen. Die Hybridisierungen wurden bei Schering in Berlin durchgeführt. Für die Analyse wurden mRNA Proben von 0, 2, 4, 6 und 8 Stunden miteinander verglichen. Ausgehend von der Fülle der Rohdaten wurden Gene ausgewählt, die im Zeitraum von 0 bis 8 Stunden mindestens zu einem Zeitpunkt 3-fach hoch- oder herunterrguliert waren. Auch in diesem Fall konnte ein Anteil von 70% der Gene der Apoptose- oder Überlebensfunktionen zugeordnet werden. Erstaunlicherweise konnten trotz der sehr unterschiedlichen Methoden zur Identifizierung regulierter Gene etwa ein gleicher Anteil von Genen identifiziert werden, denen man Apoptose- oder Überlebensfunktionen zuordnen kann. Dieser hohe Anteil spricht für eine sehr spezifische Antwort der FDCP1-Zellen bei Wachstumsfaktorentzug. Die Regulation der Apoptose nach IL-3-Entzug lässt sich nach diesen Daten nicht auf die Regulation weniger Faktoren zurückzuführen, sondern stellt eine sehr komplexe Antwort dar, die je nach Situation der jeweiligen Zelle zu einem schnelleren oder auch verzögerten Verlauf der Apoptose führt. Arrays beruhen auf der Vorwahl der gebundenen Gene. Der Atlas Array liegt nach heutigen Maßstäben mit seiner sehr limitierten Zahl von 588 Genen (etwa 1-2% aller Gene) weit hinter dem Affymetrix Chip mit etwa 5000 Genen (etwa 20-30% aller Gene). Mit 3-4 solcher Affymetrix Chips können alle Gene eines Säugertranskriptoms abgedeckt werden. Es steht außer Frage, dass diese Methode an Effektivität schwer zu überbieten ist. Ein Nachteil wird jedoch immer die Vorauswahl der Gene bleiben. Hohe Anforderungen stellt bei der Analyse von Affymetrix Chip- Hybridisierung der große Umfang der ermittelten Ergebnisse dar. Genfallensysteme beruhen auf völlig anderen Bedingungen. Sie sind nicht von einer Vorauswahl von Genen als experimenteller Randbedingung abhängig, so dass der Anteil bekannter Gene etwa dem momentanen Wissenstand zu den Funktionen aller Gene entspricht. Da das Cre-Rekombinase- Reportersystem besonders sensitiv zu sein scheint, könnte ein höherer Anteil an unbekannten bzw. niedrig exprimierten Genen nachgewiesen werden. Vergleicht man die Genfallenergebnisse mit den Affymetrixdaten, konnten nur etwa 23,5% der durch Genfallen identifizierten Gene auf dem Affymetrix Array wieder gefunden werden. Dieser geringe Anteil spricht für das Genfallensystem als System zur Identifizierung noch unbekannter Gene. Die von uns verwendete Methode zur Herstellung der Genfallen-Integrationsbank beginnt mit der Negativselektion zur Eliminierung konstitutiv aktiver Loci. Da viele Gene, wenngleich hochreguliert, auch im nichtinduzierten Zustand eine basale Expression zeigen, werden Zellklone mit Genfallenintegrationen in diesen Loci aus dem Klonpool eliminiert. Dadurch sinkt die Zahl der möglichen identifizierbaren Gene. Solche relativ hoch exprimierten Gene sind nur dann zu isolieren, wenn durch eine sehr ungünstige Provirusintegration die Translation des Cre-Reportergenes stark reduziert ist. Während der Tumorigenese kommt es in vielen Fällen zu Mutationen, Überexpressionen oder Inaktivierungen von Apoptose- oder Überlebensgenen. Verstärkte Proliferation ergibt sich nicht nur aus einer Aktivierung des Zellzyklus, sondern kann auch durch eine verminderte Apoptose verursacht werden.. Es war nun naheliegend zu untersuchen, ob aus unserer GTST-Integrationsbank weitere, vielleicht weniger bekannte Gene eine Tumor-relevante Funktion haben. Basierend auf unseren Erfahrungen mit der Arrayhybridisierung wurden 70 GTST-spezifische DNA-Proben generiert und auf eine Nitrozellulosemembran aufgebracht (sog. "custom array"). Diese Arrays wurden dann mit den cDNAs aus Tumorzellen bzw. aus normalen Geweben hybridisiert. Der Vergleich der Hybridisierungssignale ermöglicht die Eingrenzung von GTSTs mit differenzieller Expression in Tumorzellen gegenüber den jeweiligen normalen Geweben. Eine Gruppe von 7 Genen, deren Genprodukte möglicherweise Zielstrukturen für die Entwicklung von Therapeutika sein könnten, wurden ausgewählt und mit Hilfe von Matched Tumor Arrays auf ihre differenzielle Expression in Patientenproben untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass in den Tumorproben nur ERK3 und mehrere Gene für bisher unbekannte Proteine differenziell exprimiert wurden. Von diesen scheint ERK3 als mögliches Zielprotein für eine Tumortherapie von besonderer Bedeutung zu sein: 1) Die mit den Matched Tumor Arrays gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass ERK3 am stärksten in Brustkrebs (7-fach), Magenkrebs (2,5- fach) und Gebärmutterkrebs (2,3-fach) hochreguliert wird. Diese differenzielle Expression von ERK3 mit hoher Organspezifität erlaubt möglicherweise eine sehr spezifische Hemmung. 2) Es wurde bereits gezeigt, dass die Expression von ERK3 durch spezifische Inhibitoren der p38 Kinase und Proteasomen stark unterdrückt wird. Bei den Inhibitoren handelt es sich um Ableitungen von Peptiden oder kleine chemische Moleküle, was für die Entwicklung von Medikamenten von großem Vorteil ist. 3) ERK3 besitzt eine völlig unterschiedliche Phosphorylierungsstelle als die anderen ERKs. Daher sollte es möglich sein, bei der Hemmung der Aktivierung von ERK3 eine hohe Selektivität gegenüber anderen ERKs zu erreichen. 4) Es wurde nachgewiesen, dass ERK3 ein relativ kurzlebiges Protein ist (t1/2 = ca. 30 min.), was ein Targeting auch auf der transkriptionalen Ebene, z.B. durch RNA Interferenz, ermöglicht Trotz all dieser Vorteile setzt die Beurteilung von ERK3 als ein gutes Zielprotein letztendlich voraus, das die Unterdrückung der Expression oder Aktivität von ERK3 tatsächlich zur verringerten Proliferation oder verstärkten Apoptose in Tumorzellen führen wird. Da über die nachfolgenden Ereignisse der ERK3-Aktivierung bislang wenig bekannt ist, sind weitere Untersuchungen nötig, um die anti-apoptotische oder pro-proliferative Wirkung von ERK3 aufzuklären bzw. zu bestätigen.
Y1  - 2003
UR  - http://publikationen.ub.uni-frankfurt.de/frontdoor/index/index/docId/5215
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hebis:30-0000003915
ER  -