TY  - THES
A1  - Holzmann, Yvonne
T1  - Degradation und subzelluläre Lokalisation von p21(Cip1/Waf1) in Abhängigkeit von PCNA in Endothelzellen
N2  - Das Protein p21 (Cip1/Waf1/Sdi1), ein Mitglied der Familie der Cyclin abhängigen Kinasen-Inhibitoren, ist ein wichtiger Modulator des Zellwachstums und der Reaktion auf DNA-Schädigung. Die Funktion von p21 hängt von der Stabilität des Proteins ab. p21 ist besonders stabil in der Phase G0/G1 des Zellzyklus. Phoshorylierungsvorgänge sowie Interaktionen mit anderen Proteinen spielen in der Stabilität von Proteinen eine wichtige Rolle. Ziel der vorliegenden Arbeit war, herauszufinden, ob die Phosphorylierung von p21 durch die Proteinkinase AKT oder die durch diese Phosphorylierung beeinflusste Interaktion mit dem Proliferating cell nuclear antigen, kurz PCNA, einen Einfluß auf die Stabilität von p21 hat. Mittels Proteinhalbwertszeitbestimmung konnte demonstriert werden, daß die Phosphorylierung am Threonin 145 durch AKT keinen signifikanten Einfluß auf die Stabilität von p21 aufwies. Durch Pulse chase und Westem-Blot Versuche konnte aber nachgewiesen werden, daß die Anwesenheit von PCNA das Protein p21 stabilisierte und die Degradation beeinflusste. Es konnte mittels p21 Mutanten, deren PCNA- Bindung durch Austausch der Aminosäure (M147) inhibiert ist, gezeigt werden, daß nur eine direkte Bindung von PCNA an p21 die Degradation beeinflussen konnte. Die Bestimmung der subzellulären Lokalisation von p21, die zur weiteren Abklärung der erhöhten p21-Stabilität durch PCNA diente, zeigte in Immunopräzipitationsversuchen nach subzellulärer Fraktionierung eine Interaktion von p21 mit PCNA vorwiegend im Zytoplasma. Dies ließ sich auch durch Immunofluoreszenzuntersuchungen bestätigen. Schließlich zeigten die Untersuchungen, daß die subzelluläre Lokalisation von der direkten Bindung an PCNA abhängig war. Zusammenfassend zeigte die Arbeit auf, daß die Stabilität von p21 durch seinen Bindungspartner PCNA beeinflusst werden konnte, und dies vermutlich durch subzelluläre Translokation erfolgt.
N2  - p21 (Cip1/Waf1/Sdi1), a family member of Cyclin-dependent kinase-inhibitors, is an important modulator of cell-growth and cell-response to DNA damage. The action of p21 depends on its stability. It is known that p21 is more stable in G0/G1 phase ofthe cell's cycle. Its stability is regulated by post-translational mechanisms including phosphorylation and protein-protein interactions. The aim ofthe study was to investigate, if p21 stability depends on its phosphorylation by proteinkinase AKT or by interaction with PCNA, Proliferating Cell Nuclear Antigen, which depends on the AKT phosphorylation. Pulse-chase and Westem blot analysis showed that phosphorylation of p21 on Threonine 145 by AKT did not have a significant stabilisation effect. However, p21 was stabilized by the presence of PCNA. Moreover, p21 constructs, abrogated in their binding capacity to PCNA, showed that the direct binding of PCNA to p21 caused an inhibition of p21 degradation. Investigation of the subcellular localisation of both proteins helped to understand the increased stability. Furthermore, subcellular fractionation and immunoprecipitation demonstrated the localisation of p21-PCNA complex in the cytoplasm. Finally, immunofluorescence-methods confirmed the subcellular localisation of p21 and PCNA as well as the dependency of the p21 subcellular localisation on a direct binding to PCNA. In conclusion, the results of the present work proved that stability of p21 was influenced by its binding protein PCNA. As a matter of fact, subcellular translocation was supposed to be the mechanism.
Y1  - 2005
UR  - http://publikationen.ub.uni-frankfurt.de/frontdoor/index/index/docId/2845
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hebis:30-25583
CY  - Frankfurt am Main
ER  -