TY  - THES
A1  - Korkmaz, Filiz
T1  - Structure-function analysis of membrane proteins by infrared spectroscopy : Porin OmpF, Porin OmpG and Betaine transporter BetP
T1  - Struktur-Funktion Analyse von Membranproteinen bei Infrarot Spektroskopie : Porin OmpF, Porin OmpG und Betaine Transporter BetP
N2  - This study addresses the structure-function relationships of three essential membrane proteins: Porin from Paracoccus denitrificans, Porin OmpG from Eschericia coli and BetP from Corynobacterium glutamicum using Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy and Attenuated Total Reflection (ATR) techniques. The structure of porin from P. denitrificans is known for more than a decade; however, the mechanism for loss of functionality together with the monomerization was not clear. In this study we have addressed the role of lipids for the functionality of porin using FT-IR. OmpF porin was found to interact with the lipid molecules via the aromatic girdles surrounding the protein for functionality. In this study, molecular bonds and groups of the lipids were established as reporter groups probing at different depths of the bilayer in order to understand the interaction partner of the aromatic girdles of porins. Monomerization of the trimeric assembly of OmpF porin reconstituted in lipids is induced by increasing the temperature. Porin (OmpF) was found to be extremely stable: The secondary structure of the protein was unaltered up to the temperature-induced main transition, around 80-90 °C, above which it is denatured. However, the interaction of the aromatic girdle with the lipid molecules exhibited distinct changes at much lower temperature values (40 - 50°) where, according to the previous functional studies, monomerization and the loss of function occurs. The results are compared with OmpG porin from E.coli, for which the functional unit is a monomer. The aromatic girdle-lipid interaction was monitored by the tyrosine aromatic ring C=C vibrational mode, a universal marker for the protein stability and interaction. We have also found that the aromatic girdles of porins are interacting with the interfacial region of the lipid bilayer instead of lipid headgroups. Lipid-protein interaction was found to be not only essential for the structural stability, but also for the functionality of OmpF porin. We have also studied the structural properties of OmpG from E.coli. The structure of OmpG at two pH values has been resolved using X-ray crystallography and the channel has been proposed to attain different states at different pH values as closed (pH < 5.5) and open (pH >7.5). This study, using IR spectroscopy, revealed that the pH-induced opening and closing of the channel is reflected by the frequency shifts of the ? sheet structure. OmpG has more rigid ? barrel properties upon opening of the channel. IR spectral analysis revealed multiple ? sheet signals with different hydrogen bond strengths. This enabled us to monitor the formation of hydrogen bridges between the extracellular loops upon opening of the channel. The conclusion that OmpG porin having two states at different pH values was also confirmed by the three mutants where the role of the histidine pair (H231 & H261) and loop 6 has been addressed. Temperature-profiling of the wild type (WT) protein and the mutants did not show pH dependent structural stability differences in detergent solution. However, the WT protein was found to be more stable in the open form in 2D crystals than the closed form. Reconstitution into lipids has increased the transition temperature value by ~20 °C in the closed state and ~25 °C in the open state. Therefore we conclude that the open and closed state of OmpG has structural stability differences that are only revealed in the lipid environment. A comparison of the transition temperature values of OmpG WT and the mutants suggested that the hydrogen bond network among S218-H231-H261-D267, together with the formation of 12 residue-long ?-sheet contributes to the structural stability of the open channel. In the process of closing and opening of the channel, the globular structure of the protein remains mainly unchanged, while there are changes in the side chain moieties. In addition to the role of the histidine pair and the loop L6, in situ opening/closing experiments showed that the negatively charged amino acids, i.e. Asp and Glu, and Arg residues also play an active role; possibly by interacting with each other inside the pore lumen. Therefore it could be concluded that the closure of the channel at acidic pH values is not only via closing the channel entrance by loop 6, but also via changing the electric potential inside the lumen due to the different states of charged amino acids in order to effectively block the gateway. BetP from C.glutamicum attains an active and inactive state in order to adjust its glycine betaine uptake rate to the osmotic conditions that the cell encounters. The structure of BetP is not yet available. The WT protein exhibited structural differences in the presence of excess K+, which is one of the activation conditions. In 2D crystals, increasing the ionic strength to 700 mM K+ was shown to induce changes in the ?-helical moiety with contributions from the ester groups and one Tyr residue using ATR-FTIR. An increase in ionic strength to 220 mM K+ was found to be the threshold value of potassium concentration ([K+]) where the protein exhibits structural alterations in detergent solution. The determined [K+] values are in good agreement with the previous functional studies. However, there are differences in the activation profile of BetP in 2D crystals and in detergent solution, which points out that the lipids are involved in the conformational transition from the inactive to the active state and their absence can lead to different structural properties. BetP WT was found to have ~65% alpha-helix, ~25% random coil and ~10% turn structure in detergent solution. In the presence of excess K+, the WT protein is found to adapt more unordered structure. Secondary structure analysis of the mutants revealed that both the N- and C-terminus are in ?-helical conformation. Reconstitution of WT protein in 2D crystals increased the main transition (denaturation) temperature value from ~62 °C to ~85 °C, a clear indication that the protein is more stable in lipid environment. Temperature-profiling of the two forms of the WT protein revealed that the structural breakdown is preceeded by monomerization of the trimeric assembly. Comparing the two forms of the WT protein and the mutant BetA, we conclude that the oligomeric status is stabilized via the interactions among hydrophilic regions involving the N terminus. H/D exchange and activation with excess K+ in D2O-buffer revealed that activation of the protein involves the interaction of Arg and Asp/Glu residues in the cytoplasmic region of the protein. BetP WT and the two mutants tested, i.e. BetA and BetP?C45, showed differences in protein packing upon activation. The WT protein and BetP?C45 mutant also show changes in the hydrogen bonding properties of turns. Since BetA does not show such a property in activation, we conclude that the N-terminus interacts with the loops in the inactive state via the interaction of charged amino acids for the WT protein and that this interaction is altered during the activation. It could be argued that the protein packing is affected via the changes in turns upon activation. We also have found experimental evidence that one Tyr residue has different orientations in the active and inactive state of BetP. Based on the previous functional studies, it could be one of the five Tyr residues in the cytoplasmic region of the protein (in loop 3, 6, 7 or C-terminus). The mutant BetP?C45, on the other hand, showed fewer differences between the active and inactive state conditions and based on the H/D exchange rates, the mutant shows the properties of an active WT protein, proving that the C-terminal truncation impairs the conformational transition between the active and inactive states.
N2  - In der vorliegenden Arbeit werden Struktur-Funktions-Beziehungen von drei verschiedenen Membranproteinen mittels Fourier-Transformations-IR-Spektroskopie (FT-IR) und abgeschwächter Totalreflexion (ATR) untersucht. Die analysierten Membranproteine umfassen die Außenmembranproteine OmpG aus Escherichia coli und OmpF aus Paracoccus denitrificans, sowie der osmoregulierte Sekundärtransporter BetP aus Corynebacterium glutamicum. Obwohl die Struktur des P. denitrificans Porins schon seit mehr als einem Jahrzehnt bekannt ist, sind die der Monomerisierung und des Funktionsverlustes zugrundeliegenden Mechanismen unbekannt. In dieser Arbeit wurde daher die Rolle der Lipide für die Funktionalität von OmpF unter Verwendung von FT-IR untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass OmpF mit Lipidmolekülen über den sogenannten aromatischen Gürtel interagiert, welcher das Molekül an der Außenseite umgibt. Die Bindungen und Lipidgruppen, die in unterschiedlicher Tiefe der Membran lokalisiert sind, wurden damit als Reportergruppen für die Interaktion der Lipide mit dem aromatischen Gürtel identifiziert. Die Monomerisierung des in Lipiden rekonstituierten trimeren OmpF Porins wurde durch Erhöhung der Temperatur induziert. Dabei wurde festgestellt, dass OmpF extrem stabil ist: Die Sekundärstruktur des Proteins blieb bis zu der Übergangstemperatur von 80-90°C unverändert und denaturierte bei weiterer Temperaturerhöhung. Dagegen wies die Interaktion des aromatischen Gürtels mit den Lipidmolekülen bereits deutliche Änderungen bei niedrigeren Temperaturen (40-50°C) auf, wo gemäß bisheriger funktioneller Studien die Monomerisierung und der Funktionsverlust stattfindet. Die Ergebnisse der Studie am OmpF Porin aus P. denitrificans wurden mit denen vom OmpG Porin aus E. coli verglichen, bei dem die funktionelle Einheit ein Monomer ist. Die Interaktion der Lipide mit dem aromatischen Gürtel wurde mittels des C=C Vibrationsmodus des aromatischen Tyrosins, einem universellen Marker für Proteinstabilität und Interaktion, untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass der aromatische Gürtel der Porine mit der Region zwischen den Lipidkopfgruppen interagiert und nicht direkt mit ihnen. Darüber hinaus konnte für das OmpF Porin gezeigt werden, dass die Lipid-Protein-Interaktion nicht nur essentiell für die strukturelle Stabilität, sondern auch für die Funktionalität ist. Als weiteres Projekt wurden die strukturellen Eigenschaften von OmpG aus E. coli untersucht. Die dreidimensionale Struktur von OmpG wurde mittels Röntgenstrukturanalyse bei zwei pH-Werten gelöst (Yildiz et al.). Es war bekannt, dass der Kanal verschiedene Zustände bei unterschiedlichen pH-Werten einnimmt, nämlich einen geschlossenen (pH < 5,5) und einen offenen (>pH 7,5). In der vorliegenden Arbeit wurde mittels IR-Spektroskopie gezeigt, dass das pH-induzierte Öffnen und Schließen durch Frequenzverschiebung der ?-Faltblatt Struktur wiedergegeben wird. OmpG besitzt rigidere ? Fass Eigenschaften wenn der Kanal geöffnet ist. Die Auswertung der IR-Spektren ergab, dass mehrere ?-Faltblattsignale mit unterschiedlichen Wasserstoffbindungsstärken vorliegen. Diese Beobachtung ermöglichte uns, die Ausbildung der Wasserstoffbrücken zwischen den extrazellulären Schleifen bei der Öffnung des Kanals zu verfolgen. Den pH abhängigen Kanalzustand des OmpG Porins konnte auch durch drei Mutanten bestätigt werden, bei denen die Rolle des Histidin-Paares (H231 und H261) und der Schleife L6 untersucht wurde. Das Temperaturprofil des Wildtyp-Proteins (WT) und der Mutanten zeigte keine pH-abhängigen strukturellen Stabilitätsunterschiede, wenn das Protein in Detergenzlösung vorlag. War das WT Protein jedoch in 2D Kristallen eingebettet, stellte sich heraus, dass es im offenen Zustand stabiler war als im geschlossenen. Die Rekonstitution in Lipide hat dabei die Übergangstemperatur um ~20°C für den geschlossenen und ~25°C für den offenen Kanalzustand erhöht. Es konnte geschlussfolgert werden, dass der offene und geschlossene Zustand von OmpG strukturelle Stabilitätsunterschiede besitzt, die jedoch nur in der Lipidumgebung nachweisbar waren. Ein Vergleich der gemessenen Übergangstemperaturwerte von OmpG-WT mit denen der Mutanten deutet an, dass das Wasserstoffbrücken-Netzwerk zwischen S218-H231-H261-D267, zusammen mit der Ausbildung von einem zwölf Reste umfassenden Faltblatt zur strukturellen Stabilität des offenen Kanals beiträgt. Im Prozess des Schließens und Öffnens bleibt die Gesamtstructure des Proteins unverändert, während Änderungen der Seitenkettenpositionen vorliegen. Zusätzlich zu der Rolle des Histidin-Paares und der Schleife L6 haben in situ Experimente gezeigt, dass die negativ geladenen Aminosäuren Asp und Glu sowie Arg Reste auch eine aktive Rolle spielen, möglicherweise durch Interaktionen miteinander im Porenlumen. Daher kann angenommen werden, dass das Schließen bei saurem pH-Wert nicht allein am Kanaleingang durch Schleife L6 stattfindet, sondern auch über eine Änderung des elektrischen Potentials im Lumen, was zu unterschiedlichen Zuständen von geladenen Aminosäuren und schließlich zu einem effizienten Kanalverschluss führt. BetP aus C. glutamicum kann in einem aktiven und inaktiven Zustand vorliegen und dient dem Schutz der Zelle, indem es Änderungen von osmotischen Bedingungen durch einen Transport von Glycin-Betain kompensiert. Die dreidimensionale Struktur von BetP (ist zwar bislang noch nicht verfügbar) jedoch ist bekannt, dass die Zugabe eines Überschusses an K+-Ionen strukturelle Unterschiede zur Folge hat. Damit ist K+ bei der Aktivierung des Transports beteiligt. In der vorliegenden Arbeit konnte mittels ATR-FTIR gezeigt werden, dass die Erhöhung der Ionenstärke auf 700 mM in 2D Kristallen Änderungen des ?-helikalen Anteils induziert, wobei Estergruppen und ein Tyr Rest beteiligt sind. Die Erhöhung der Ionenstärke auf 220 mM K+ wurde als Grenzwert der Kaliumkonzentration ([K+]) bestimmt, bei der das Protein strukturelle Änderungen in Detergenzlösung aufwies. Die definierten [K+] Werte stehen in guter Übereinstimmung mit vorhergehenden funktionalen Studien. Dennnoch gibt es Unterschiede im Aktivitätsprofil von BetP in 2D Kristallen und in Detergenzlösung. Diese Unterschiede weisen darauf hin, dass Lipide beim Konformationsübergang vom inaktiven zum aktiven Zustand involviert sind und dass ihre Abwesenheit andere strukturelle Eigenschaften zur Folge hat. In Detergenzlösung wurde der ?-helikale Anteil von BetP WT mit ~65% bestimmt, ~25% liegen als random coil vor und ~10% als Turns. In Anwesenheit eines K+-Überschusses nimmt das WT-Protein eine ungeordnetere Struktur an. Sekundärstrukturanalysen von mutiertem BetP zeigten, dass sowohl N- als auch C-Terminus in einer ?-helikalen Konformation vorliegen. Rekonstitution des WT Proteins in 2D Kristalle erhöhte die Temperatur des Hauptübergangszustandes (Denaturierung) von etwa 62°C auf 85°C, ein klarer Indikator dass das Protein stabiler in Lipidumgebung vorliegt. Die Temperaturprofile der zwei Formen des WT Proteins zeigt, dass die Monomerisation der trimeren Anordnung dem strukturellen Zusammenbruch vorausgeht. Der Vergleich der beiden Formen des WT Proteins und der Mutante BetA ließ die Schlussfolgerung zu, dass der oligomere Zustand über die Interaktionen entlang der hydrophilen Regionen stattfindet, einschließlich dem N-Terminus. H/D Austausch-Experimente mit einer einhergehenden Proteinaktivierung durch K+ Überschuss im D2O Puffer zeigt, dass die Interaktionen von Arg und Asp/Glu Resten auf der cytoplasmatischen Region involviert sind. BetP WT und die beiden getesteten Mutanten, d.h. BetA und Bet?C45, zeigten Unterschiede in der Proteinpackung nach Aktivierung. Das WT Protein und die BetP?C45 Mutante zeigten zudem Unterschiede in den Eigenschaften der Wasserstoffbrücken Eigenschaften in den Turns. Da BetA solch eine Eigenschaft nach Aktivierung nicht zeigt, konnte geschlussfolgert werden, dass der N-Terminus beim WT Protein mit den Schleifen im inaktiven Zustand über die Interaktion der geladenen Aminosäuren interagiert und dass sich diese Interaktion während der Aktivierung verändert. Es kann angenommen werden, dass die Proteinpackung über Änderungen in den Turn-Bereichen nach Aktivierung beeinflusst ist. Wir fanden experimentelle Beweise, dass ein Tyr Rest unterschiedliche Orientierung im aktiven und inaktiven Zustand von BetP besitzt. Basierend auf vorhergehende funktionale Studien könnte es einer der fünf Tyr Reste in der cytoplasmatischen Region des Proteins sein (in Schleife drei, sechs, sieben oder dem C Terminus). Die Mutante BetP(del)C45 hingegen zeigte weniger Unterschiede zwischen dem aktiven und inaktiven Zustand sowie basierend auf den H/D Austauschraten, zeigt diese Mutante Eigenschaften eines aktiven WT Proteins, was beweist, dass die C-terminale Verkürzung den Konformationsübergang zwischen dem aktiven und inaktivem Zustand beeinflusst.
KW  - FT-IR-Spektroskopie
KW  - Membranproteine
KW  - Betain
KW  - Porin
KW  - Sekundärstruktur
KW  - Temperaturbeständigkeit
KW  - BetP
KW  - OmpG
KW  - OmpF
KW  - Osmosensor
KW  - Protein-Lipid Wechselwirkung
KW  - H/D Austausch
KW  - ATR-Spektroskopie
KW  - FT-IR-Spectroscopy
KW  - Membraneproteins
KW  - Betain
KW  - Porin
KW  - Secondary Structure
KW  - Thermal Stability
KW  - BetP
KW  - OmpG
KW  - OmpF
KW  - Osmosensor
Y1  - 2009
UR  - http://publikationen.ub.uni-frankfurt.de/frontdoor/index/index/docId/6349
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hebis:30-63847
ER  -